גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח
Summary
כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.
Abstract
המטרה הבסיסית הן המוח בסיסי וקליני היא להבין טוב יותר את זהויות, איפור מולקולרית, ודפוסי קישוריות האופייניים הנוירונים במוח שניהם בריאים וחולים. לקראת זה, במידה רבה של מאמץ הושם על מבנה ברזולוציה גבוהה מפות neuroanatomical 1-3. עם ההתרחבות של גנטיקה מולקולרית ההתקדמות במיקרוסקופ אור הגיע היכולת השאילתה לא רק מורפולוגיות העצבית, אלא גם את האיפור מולקולרית תאית של נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם 4. התקדמות גדולה ביכולת לסמן ולטפל הנוירונים באמצעות טכנולוגיות המיקוד ואת מהונדס גנטי מכרסם כעת לאפשר לחוקרים תת נוירונים "התוכנית כרצונו 5-6. ניתן לטעון, אחת התרומות המשפיעים ביותר על בני זמננו מדעי המוח כבר גילוי שיבוט של הגנים המקודדים חלבונים ניאון (fps) ב 7-8 חוליות ימיים, לצד הנדסת הבאים שלהם תשואה הכלים המתרחבת של כתבים חיוני 9. ניצול הספציפיים לסוג תא מקדם פעילות לנהוג ממוקד ביטוי FP באוכלוסיות עצביות נפרדות עכשיו מאפשר חקירה neuroanatomical בדייקנות גנטית.
הנדסה ביטוי FP בנוירונים השתפר בהרבה להבנת מבנה המוח ותפקודו. עם זאת, הדמיה נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם ברקמות המוח עמוק, או בשלושה ממדים, נשאר אתגר. בשל תוכן שומנים גבוהה, רקמת העצבים היא אטומה ולא ותערוכות פלואורסצנציה אוטומטי. מאפיינים אלה biophysical הטמון להקשות לדמיין ותמונה נוירונים שכותרתו fluorescently ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal תקן מעבר מעמקי עשרות מיקרונים. כדי לעקוף את זה לעתים קרובות החוקרים אתגר להעסיק הדמיה סדרתי סעיף דק שיטות השחזור 10, או 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר 11. חסרונות הנוכחית כדי גישות אלו הם הכנה הקשורים עתירי עבודה רקמות, או עלות אוסרני מכשור בהתאמה.
כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה יחסית לדמיין תאים שכותרתו fluorescently ב קבוע למחצה עבה פרוסות המוח עכבר ידי ניקוי הדמיה אופטית. בפרוטוקול המצורף אנו מתארים את שיטות: 1) תיקון רקמת המוח באתרו דרך זלוף intracardial, 2) דיסקציה והסרה של המוח כולו, 3) הטבעה המוח נייח agarose, 4) חצי פרוסה עבה דיוק הכנה באמצעות מכשור חדש vibratome , 5) המוח ניקוי רקמות באמצעות צבע גליצרול, ו 6) גובר על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ אור Z-מחסנית שחזור (איור 1).
להכנת פרוסות המוח יישמנו יצירה חדשה יחסית של מכשור בשם "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). מכשיר זה הוא microtome חצי אוטומטיות מצויד מראש ממונע ותנודות מערכת להב עם תכונות דומות פונקציה vibratomes אחרים. בניגוד vibratomes אחרות, רקמת להיות פרוס מותקן בתקע agarose בתוך גליל נירוסטה. הרקמה הנמתח על עובי הרצוי מתוך גליל, וחותכים ידי להב רוטט קדימה לקידום. התוספת agarose / מערכת גליל מאפשר לשחזור רקמות הרכבה, יישור, חיתוך מדויק. בידיים שלנו, "Compresstome" תשואות גבוהות רקמות איכות פרוסות עבור electrophysiology, אימונוהיסטוכימיה, ישיר רקמה קבועה הרכבה והדמיה. בשילוב עם ניקוי אופטית, כאן אנחנו מדגימים הכנת למחצה עבה פרוסות המוח קבוע עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ניאון.
Protocol
Discussion
לאור יישום נרחב של חלבונים באמצעות פלורסנט למקד תת נוירונים לחקירה באמצעות מיקרוסקופ אור, הצורך במהירות המסך, תמונה, ולנתח רשתות עצביות בתוך רקמת המוח שלם הפך יסולא בפז.
ההתקדמות הטכנית בפיתוח ידידותי למשתמש וקטורים ויראליים, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי תמיכה באמצעות קרן מקניר, NARSAD ו NINDS מענק R00NS064171-03.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. . The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, . Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
