HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

1. Создание, HLA-A2-Ig основан AAPC Подготовка стерильного буфера борат Растворите борной кислоты в воду, чтобы сделать 0,1. Скорректировать значение рН до 7,0. Фильтра через 0.22μm стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° C. Подготовка стерильного бисера промывочный буфер Возьмите 956ml PBS без магния или кальция. Добавить 30 мл человеческой сыворотки АВ. Добавить 2 мМ ЭДТА конечной концентрации. Добавить 0.1gsodium азида. Фильтр по 0,22 мкм стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° C. Возьмите 1 мл Invitrogen М-450 бусин эпоксидной со склада, около 400 миллионов бусины (бисер, можно пересчитать по гемоцитометра), и положить в стерильный, с завинчивающейся крышкой стеклянный пузырек. Поместите флакон против Dynal магнит MPC-1, в то время как бусины придерживаться стороне флакона, удалить супернатант аспирацией. Вымойте бисером один раз с 1 мл буфера борат. Ресуспендируют бисером в смеси 1 мл буфера борат и 20 мкг HLA-A2-Ig димера и 20 мкг анти-CD28 МКА человека (Clone 9.3). Белки к борту сопряжения: положить стеклянные флаконы по ротатора и вращать при 4 ° С в течение 24 часов. Поместите пробирку в MPC-1 магнита и удалить все боратный буфер. Вымойте бисером дважды с 1 мл промывочного буфера из бисера. Инкубируйте бисером в 1 мл промывочного буфера из бисера, вращать при 4 ° С в течение 24 часов. Из бисера промывочного буфера, содержащие человеческую сыворотку AB, он будет блокировать все остаточные связывания с белками сайта на бусы. Удалить супернатант из стекла флакона, заменить 1 мл свежей бисера промывочным буфером. 2. Контроль качества AAPC и пептид размещения, хранения Добавить ~ 5 × 10 5 бусин на 100 мкл промывочного буфера FACS в трубах FACS, и пятна с 1 мкл анти-мышь IgG1-PE (признать Fc части HLA-A2-Ig) и 1 мкл анти-мыши IgG2a-FITC (признать Fc часть анти-CD28 МКА). После окрашивания в течение 20 минут в FACS промывочный буфер, мыть снова и прочитайте результат окрашивания немедленно потока цитометр (рис. 4). Пептид погрузки на бисера: мыть дважды в бисер стеклянный флакон с 1 мл стерильной PBS. Ресуспендируют с 1 мл стерильной PBS затем добавить 10 мкл ЦМВ-пептида (1mg/ml) Граф бисером по гемоцитометра, и этикетку флакона с указанием даты и концентрации. AAPC готовы к использованию после по крайней мере 3 дня пептид инкубации при 4 ° С, чтобы было достаточно времени пептидных обязательным на HLA-A2-Ig димера. Бисера можно хранить при температуре 4 ° С и оставаться функциональным по крайней мере 6 месяцев. 3. Человек изоляции CTL Сбор ~ 100 мл свежего периферической крови здоровых HLA-A2 положительного донора на 10 BD натрия труб Гепарин Vacutainer. Использование 21-иглы или больше, чтобы предотвратить гемолиз. Центрифуга на 300xg в течение 10 минут при комнатной температуре Осторожно снимите верхний слой плазмы аспирации. Плазма может быть использована в качестве дополнения для культуральной среды. Замените собранные плазмы стерильной PBS и передачи кровь в стерильные колбы T75 культуры или 50 мл конические пробирки. Смешать кровь с PBS также с помощью пипетки вверх и вниз. После того как все кровь собирают, готовят четыре дополнительных 50 мл конические пробирки и добавить 15 мл Ficoll-Paque Plus. Медленно наложения 30-35мл клеток крови в верхней части Ficoll каждой трубы. Держите интерфейс между различными Ficoll и клетки крови. Центрифуга на 500xg в течение 20 минут при комнатной температуре. Включите тормоз "выключено" и ускорение как можно ниже, чтобы сохранить ясный интерфейс между слоями. Использование seriological пипетки, тщательно аспирата РВМС слой и собирать РВМС в свежем 50 мл коническую трубку. Когда все РВМС собирают добавить 30 мл PBS и спина на 400xg течение 10 мин. Удалите супернатант и промыть еще раз с 30 мл PBS для удаления остатков Ficoll. Приступить к CD8 + Т-клеток изоляции с помощью Miltenyi человека CD8 + Т-клеток изоляции комплект в соответствии с протоколом производителя. Этот набор очень обогащает для CD8 + клеток (обычно> 95%) за счет истощения CD8 – клеток. Граф CD8 + Т-клеток. Ожидается чистота должна быть больше 95%. Для подтверждения этого использовать 2х10 5 клеток и выполняют CD4/3/8 FACS анализ. Остальные CTL может быть использован сразу для антиген-специфической AAPC стимуляции или они могут быть заморожены для дальнейшего использования. 4. В пробирке AAPC система культуры Подготовка питательной среды Для TF (Т-клеточный фактор роста, сделанный в лаборатории 4) 2X культуральной среде: полной среде RPMI плюс 5% доноров аутологичной плазмы и 8% Т-клеток фактор роста. <li> Донора аутологичной плазмы может быть заменен тепла инактивированной человеческой АВ сыворотки. Ресуспендируют 1 млн CTL в 8 мл ТФ 2X культуральной среде плюс 8 мл полной среды RPMI, добавить 1 × 10 6 AAPC, хорошо перемешать. Использование многоканальных pipetter к пластине клеток на 96-U нижней пластины тканевой культуры. (160 мкл на лунку) Культуры клеток в 37 ° С, 5% СО 2 incubater течение 7 дней. Поток клеток на 4-й день с 80 мкл / лунку средой TF 2X. Клетки готовы быть собраны на 7 день. После сбора урожая, место клетки от магнита и удалить старый AAPC. Антиген специфичность может быть определена путем окрашивания тетрамер в соответствии с протоколом производителя. Окрашивание Фенотип и внутриклеточных цитокинов окрашивание производится в соответствии с нашими предыдущими 3 исследования. Собранные клетки могут быть replated с AAPC снова на тех же условиях. Число клеток и антигенной специфичности, как ожидается, увеличится после повторной стимуляции. 5. Представитель Результаты: Примером AAPC после конъюгации HLA A2-Ig и анти-CD28 показано на рисунке 4. Успешное сопряжения белок очевидным явный сдвиг соответствующих меченых антител. В то время как частота ЦМВ конкретных CTL в периферической крови, как правило, 0,5-1%, после одной недели AAPC-опосредованной стимуляции, специфичность может достигать 55 – 93% (рис. 2 и 3). Расширение антиген специфический CTL могут быть самыми разными между различными донорами, но результаты воспроизводимы в пределах того же донора. По экстраполяции, расширения ЦМВ специфические клетки могут быть тысячи раз по сравнению с предшественником уровней непосредственно бывших естественных условиях (данные не приведены). Внутриклеточного окрашивания цитокинов (рис. 3) показывает, что эти расширенные CTL являются полифункциональные, а не исчерпан, после длительных клеточных культур и значительного распространения. Рисунок 1. Представителю блок-схема AAPC основан расширения естественных ех человек CTL для приемных иммунотерапии в аллогенных ГСК Рисунок 2. Представителю тетрамер окрашивания результат ЦМВ конкретных CTL порожденных AAPC после одной недели культуры Рисунок 3. Представителю внутриклеточных результат окрашивания цитокинов ЦМВ конкретных CTL порожденных AAPC (специфичность ЦМВ был 61%) Рисунок 4. Представителю результат окрашивания М-450 бусин эпоксидной после белка сопряжения окрашенных анти-мышиные IgG1-PE и анти-мышь IgG2-FITC