HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

1. Fazendo, HLA-A2-Ig baseada AAPC Prepare tampão borato estéril Dissolver o ácido bórico em água para fazer 0,1 M. Ajustar o pH para 7,0. Filtrar através de filtro estéril 0.22μm e armazenar a 4 ° C. Prepare tampão de lavagem estéril Bead Tome 956ml PBS magnésio w / o ou cálcio. Adicionar 30ml de soro humano AB. Adicionar EDTA 2mM concentração final. Adicionar 0.1gsodium azida. Filtrar com um filtro de 0,22 mM estéril e armazenar a 4 ° C. Tomar 1ml de contas Invitrogen M-450 Epoxy do estoque, aproximadamente 400 milhões de contas (contas pode ser contado por hemocitômetro), e colocado em um, frasco de vidro estéril parafuso superior. Colocar o frasco contra um ímã Dynal MPC-1, enquanto as contas aderir à parede do frasco, retire o sobrenadante por aspiração. Lavar contas uma vez com 1ml de tampão borato. Contas ressuspender em uma mistura de tampão borato 1ml e 20 mcg de HLA-A2-Ig dímero e 20 mg de anti-CD28 humano mAb (Clone 9.3). Proteína para a conjugação talão: coloque o frasco de vidro sobre rotador e gire a 4 ° C por 24 horas. Colocar o tubo no MPC-1 ímã e remover todos tampão borato. Lave as contas duas vezes com tampão de lavagem 1ml Bead. Incubar as contas em tampão de lavagem 1ml Bead, gire a 4 ° C por 24 horas. Porque tampão de lavagem contém Bead humana soro AB, ele irá bloquear todos os sites de proteína residual vinculativo sobre as contas. Remover o sobrenadante do frasco de vidro, substitua por 1 ml tampão de lavagem fresca Bead. 2. Controle de qualidade dos AAPC e peptídeo de carga, armazenamento Adicionar ~ 5 × 10 5 contas para FACS 100μl tampão de lavagem em tubos FACS, e mancha com 1μl de anti-mouse IgG1-PE (reconhecer a parte Fc de HLA-A2-Ig) e 1μl de anti-mouse IgG2a-FITC (reconhecer a parte Fc de anti-CD28 mAb). Após coloração por 20 minutos em FACS tampão de lavagem, lave novamente e ler o resultado coloração imediatamente por citômetro de fluxo (Figura 4). Loading peptídeo para as contas: lavar as contas duas vezes em frasco de vidro com 1 ml estéril PBS. Ressuspender com 1ml de PBS estéril, em seguida, adicionar 10μl de peptídeo CMV (1mg/ml) Contar as contas por hemocitômetro, e rotular o frasco com data e concentração. AAPC está pronto para uso após pelo menos 3 dias de incubação peptídeo a 4 ° C, para dar tempo suficiente de ligação de peptídeos para o dímero HLA-A2-Ig. As esferas podem ser armazenados a 4 ° C e permanecer funcional por pelo menos seis meses. 3. CTL isolamento humano Coletar ~ 100ml de sangue periférico fresco de doadores HLA-A2 saudável e positiva em 10 de sódio BD tubos Vacutainer Heparina. Use uma agulha calibre 21 ou maior para evitar a hemólise. Centrifugar a 300xg por 10 minutos em temperatura ambiente Remova cuidadosamente a camada de plasma topo por aspiração. O plasma pode ser utilizado como suplemento para o meio de cultura. Substituir o plasma coletado com PBS estéril e transferir o sangue para um balão de cultura estéreis T75 ou tubos cônicos de 50ml. Misturar o sangue com PBS bem pipetando cima e para baixo. Uma vez que todo o sangue é coletado, prepare mais quatro tubos de 50ml cónico e adicionar 15ml de Ficoll-Paque Plus. Lentamente sobreposição de 30 35ml de células do sangue em cima do Ficoll de cada tubo. Manter a interface entre as distintas Ficoll e células do sangue. Centrifugar a 500xg por 20 minutos em temperatura ambiente. Ligue o freio "off" ea aceleração tão baixo quanto possível manter uma relação clara entre as camadas. Com uma pipeta serológico, aspirar cuidadosamente a camada de PBMC e recolher o CMSP em um tubo cônico de 50ml fresco. Quando todas as PBMC são colhidas adicionar 30ml de PBS e giram em 400xg por 10 min. Desprezar o sobrenadante e lavar mais uma vez com PBS 30ml para remover todos os Ficoll residual. Proceder para isolamento de células CD8 + T usando Miltenyi humana CD8 + T kit de isolamento de células de acordo com o protocolo do fabricante. Este kit altamente enriquece de células CD8 + (geralmente> 95%), esgotando CD8 – células. Contar as células T CD8 +. A pureza esperada deve ser superior a 95%. Para confirmar essa utilização 2×10 5 células e realizar uma análise CD4/3/8 FACS. O CTL restante pode ser utilizado de imediato para a estimulação antígeno-específica AAPC ou eles podem ser congelados para uso futuro. 4. In vitro sistema de cultivo baseado AAPC Prepare meio de cultura Para TF (T fator de crescimento celular, feita no laboratório 4) 2X meio de cultura: meio RPMI completo, mais 5% de doadores autólogos plasma e 8% T fator de crescimento celular. <li> Plasma de doadores autólogos pode ser substituído por inativado pelo calor humano AB soro. Ressuspender CTL 1 milhão em 8ml de TF meio de cultura 2X mais 8ml de meio RPMI completo, adicionar 1 × 10 AAPC 6, misture bem. Use uma pipeta multi-canal para as células em placa de 96 poços fundo U placas de cultura de tecidos. (160 mL por poço) Células de cultura em 37 ° C, 5% CO 2 incubater durante 7 dias. Alimentar as células no dia 4 com 80 mL bem TF / médio 2X. As células estão prontas para serem colhidas no dia 7. Após a colheita, coloque as células contra o ímã e remova a AAPC de idade. Especificidade do antígeno pode ser determinada através da coloração tetrâmero acordo com o protocolo do fabricante. Coloração fenótipo e coloração de citocinas intracelulares são realizadas de acordo com nossos 3 estudo anterior. As células podem ser colhidas com replated AAPC novamente sob as mesmas condições. Número de células e especificidade do antígeno é esperado um aumento após a estimulação repetida. 5. Resultados representativos: Um exemplo de AAPC após conjugação HLA A2-Ig e anti-CD28 é mostrado na Figura 4. Conjugação de proteínas de sucesso é evidente uma clara mudança de coloração do anticorpo correspondente. Enquanto a freqüência de CMV CTL específicas no sangue periférico é tipicamente 0,5-1%, após uma única semana de AAPC mediada estimulação, a especificidade pode chegar a 55-93% (Figura 2 e 3). A expansão da CTL antígeno específico pode ser muito variável entre os diferentes doadores, mas os resultados são reprodutíveis dentro do mesmo doador. Por extrapolação, a expansão de células CMV específicos podem ser milhares de vezes em comparação com os níveis de precursor diretamente ex vivo (dados não mostrados). Coloração de citocinas intracelulares (Figura 3) mostra que essas CTL expandidas são polifuncionais, ao invés de exausto, depois de cultura de células prolongada e proliferação significativa. Figura 1. Gráfico Representante fluxo de expansão vivo baseado ex AAPC de CTL humanos para imunoterapia adotiva em alogênico HSCT Figura 2. Representante resultado coloração tetrâmero de CMV CTL específicos gerados por AAPC após uma semana de cultura Figura 3. Resultado coloração intracelular de citocinas Representante da CMV CTL específicos gerados pela AAPC (CMV especificidade foi de 61%) Figura 4. Coloração resultado Representante do M-450 contas Epoxy após conjugação de proteínas marcadas com anti-camundongo IgG1-PE e anti-mouse IgG2-FITC