HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

1. ביצוע, HLA-A2-איג מבוסס aAPC הכן חיץ borate סטרילי ממיסים חומצת בור מים כדי להפוך 0.1M. התאם את ה-pH ל 7.0. סינון דרך המסנן בחנות סטרילי 0.22μm ובו 4 ° C. הכן לשטוף סטרילי חיץ ביד קח 956ml PBS w / o מגנזיום או סידן. הוסף 30 מ"ל האדם א.ב. בסרום. הוסף EDTA בריכוז 2mm הסופי. הוסף 0.1gsodium אזיד. סינון דרך פילטר סטרילי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. קח 1ml של Invitrogen M-450 חרוזים אפוקסי מן המניות, כ -400 מיליון חרוזים (חרוזים ניתן לספור על ידי hemocytometer), ולשים לתוך צנצנת סטרילית, בראש הבורג זכוכית. שים את הבקבוקון נגד מגנט Dynal MPC-1, בעוד החרוזים לדבוק בצד של הבקבוקון, להסיר את supernatant על ידי שאיפה. לשטוף חרוזים פעם עם 1ml של חיץ borate. חרוזים Resuspend בתערובת של חיץ borate 1ml ו -20 מיקרוגרם של HLA-A2-איג דימר ו -20 מיקרוגרם של אנטי אנושי CD28 מב (Clone 9.3). חלבון הצמידה חרוז: לשים את בקבוקון זכוכית על הכתף וסיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מניחים את הצינורית מגנט MPC 1-ולהסיר את כל חיץ borate. שטפו את החרוזים פעמיים עם חיץ ביד 1ml לשטוף. דגירה חרוזים במאגר 1ml לשטוף ביד, לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בגלל החיץ לשטוף ביד האדם מכיל א.ב. בסרום, זה יהיה לחסום את כל האתר חלבון שיורית מחייבים החרוזים. הסר את supernatant מתוך בקבוקון זכוכית, להחליף עם חיץ לשטוף 1ml טרי ביד. 2. בקרת איכות של aAPC ו פפטיד טעינה, אחסון הוסף את ~ 5 × 10 5 חרוזים FACS 100μl כביסה חיץ צינורות FACS, ואת הכתם עם 1μl של אנטי עכבר IgG1-PE (מכירים את החלק Fc של HLA-A2-איג) ו 1μl של אנטי עכבר IgG2a-FITC (להכיר החלק Fc של אנטי CD28 מב). לאחר מכתים במשך 20 דקות ב FACS כביסה חיץ, לשטוף שוב לקרוא את התוצאה מכתים מיד cytometer זרימה (איור 4). טעינת פפטיד על החרוזים: לשטוף את החרוזים פעמיים בקבוקון זכוכית עם 1ml סטרילי PBS. Resuspend עם 1ml סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 10μl של CMV פפטיד (1mg/ml) הרוזן חרוזים ידי hemocytometer, ואת התווית בקבוקון עם תאריך וריכוז. aAPC מוכנים לשימוש לאחר לפחות 3 ימים דגירה פפטיד ב 4 ° C, כדי לאפשר זמן מספיק מחייב פפטיד על דימר HLA-A2-איג. החרוזים ניתן לאחסן 4 ° C ולהישאר תפקודית למשך חודש לפחות 6. 3. בידוד האדם CTL איסוף ~ 100 מ"ל של דם היקפיים טרי מתורם HLA-A2 בריא חיובית לתוך 10 הפרין BD צינורות נתרן Vacutainer. שימוש במחט 21-מד או יותר כדי למנוע המוליזה. צנטריפוגה ב 300xg במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להסיר את השכבה העליונה פלזמה על ידי שאיפה. פלזמה יכולה לשמש תוספת עבור המדיום לתרבות. החלף את הפלזמה שנאספו עם סטרילי PBS ולהעביר את הדם לתוך בקבוק סטרילי תרבות T75 או 50 מ"ל צינורות חרוטי. מערבבים את הדם עם PBS היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר כל הדם נאסף, להכין וארבעה 50 מ"ל צינורות חרוטי ולהוסיף 15ml של פלוס Ficoll-Paque. לאט לאט כיסוי 30-35ml של כדוריות דם על גבי Ficoll של צינור אחד. שמור ממשק ברורים בין Ficoll ותאי דם. צנטריפוגה ב 500xg במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפעל את בלם "כבוי" ואת האצת נמוך ככל האפשר כדי לשמור על ממשק ברור בין השכבות. בעזרת פיפטה seriological, לשאוב בזהירות את השכבה PBMC לאסוף את PBMC לתוך צינור חרוטי טרי 50 מ"ל. כאשר PBMC כל נקצרים להוסיף 30 מ"ל של PBS ו ספין על 400xg במשך 10 דקות. בטל supernatant לשטוף פעם נוספת עם 30 מ"ל PBS כדי להסיר את כל Ficoll שיורית. המשך בידוד תא T CD8 + באמצעות Miltenyi האדם CD8 + T תא הבידוד בערכה על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו מעשירה מאוד עבור CD8 + תאים (בדרך כלל> 95%) על ידי depleting CD8 – תאים. הרוזן CD8 + T תאים. טוהר צפוי להיות יותר מ 95%. כדי לאשר להשתמש 2×10 5 תאים לבצע ניתוח CD4/3/8 FACS. CTL הנותרים ניתן להשתמש גם מיד לגירוי-אנטיגן ספציפי aAPC או שהם יכולים להיות קפוא לשימוש עתידי. 4. במערכת aAPC תרבות חוץ גופית מבוסס הכן בינוני תרבות עבור TF (צמיחה תא T גורם, שנעשו במעבדה 4) 2X תרבות בינוני: להשלים בינוני פלוס RPMI התורם 5% עצמיים פלזמה ו – 8% צמיחה T גורם התא. <li> פלזמה התורם עצמיים ניתן להחליף על ידי החום האנושי מומת א.ב. בסרום. Resuspend 1,000,000 CTL ב 8ml של המדיום 2X תרבות TF פלוס 8ml של המדיום RPMI להשלים, להוסיף 1 × 10 6 aAPC, ומערבבים היטב. השתמש pipetter מרובת ערוצים לתאי צלחת על 96 גם רקמות U בתחתית צלחות תרבות. (160 μl לכל טוב) תאים תרבות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 incubater למשך 7 ימים. להאכיל את התאים ביום 4 עם 80 μl בינוני / טוב 2X TF. תאים מוכנים שנקטפו ביום 7. לאחר הקטיף, המקום התאים כנגד המגנט ולהסיר את aAPC הישן. סגוליות Antigen ניתן לקבוע על ידי מכתים tetramer על פי פרוטוקול של היצרן. מכתים הפנוטיפ ואת מכתים ציטוקינים תאיים מבוצעות על פי 3 במחקר הקודם שלנו. התאים נקצרו ניתן replated עם aAPC שוב באותם תנאים. מספר תאים סגוליות אנטיגן צפוי לגדול לאחר גירוי חוזר. 5. נציג תוצאות: דוגמה aAPC לאחר נטיה HLA-A2 איג אנטי CD28 מוצג באיור 4. נטיה חלבון מוצלח ניכר על ידי שינוי ברור של נוגדן מכתים המקביל. בעוד שכיחות CMV CTL הספציפיים בדם ההיקפי הוא בדרך כלל 0.5-1%, לאחר שבוע אחד של גירוי aAPC בתיווך, סגוליות יכול להגיע 55-93% (איור 2 ו -3). הרחבת CTL אנטיגן ספציפי יכול להיות משתנה מאוד בין תורמים שונים, אבל התוצאות הן לשחזור בתוך התורם זהה. על ידי ניפוח, התרחבות של תאים ספציפיים CMV ניתן אלפי לקפל לעומת רמות מבשר ישירות vivo לשעבר (מידע לא מוצג). מכתים ציטוקינים תאיים (איור 3) מראה כי אלה הם polyfunctional CTL מורחבת, ולא מותשים, לאחר תרבית תאים ממושכת התפשטות משמעותית. באיור 1. תרשים זרימה נציג של aAPC הרחבה vivo מבוסס לשעבר של CTL האדם חיסוני המאמצת ב allogeneic HSCT 2. איור נציג מכתים tetramer תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC לאחר שבוע של תרבות איור 3. מכתים נציג תאיים ציטוקינים תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC (סגוליות CMV היה 61%) איור 4. התוצאה מכתים נציג M-450 חרוזים אפוקסי לאחר נטיה חלבון מוכתם אנטי עכבר IgG1-PE ואנטי עכבר IgG2-FITC