HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

1. Making, HLA-A2-Ig Basis AAPC Bereiten Sie sterile Boratpuffer Lösen Sie Borsäure in Wasser bis 0,1 zu machen. Den pH-Wert auf 7,0. Filter durch einen 0,22 &mgr; m Sterilfilter und lagern bei 4 ° C. Bereiten Sie sterile Bead Waschpuffer Nehmen Sie 956ml PBS w / o Magnesium oder Calcium. Fügen Sie 30ml humanem AB-Serum. Add EDTA 2 mM Endkonzentration. Add 0.1gsodium Azid. Filter durch ein 0,22 um sterile Filter und lagern bei 4 ° C. Nehmen Sie 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy Perlen ab Lager, rund 400 Millionen Beads (Perlen können von Zählkammer gezählt werden), und in eine sterile, Schraubverschluss Glasfläschchen. Legen Sie die Flasche gegen eine Dynal Magneten MPC-1, während die Perlen an der Seite des Fläschchens haften, entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Wash Perlen einmal mit 1 ml Boratpuffer. Resuspendieren Perlen in einer Mischung aus 1 ml Boratpuffer und 20 ug HLA-A2-Ig-Dimer und 20 ug anti-human CD28 mAb (Clone 9,3). Protein zu Wulst Konjugation: put der Glasflasche auf Rotator und drehen bei 4 ° C für 24 Stunden. Das Röhrchen wird in MPC-1 Magnet und entfernen Sie alle Boratpuffer. Waschen Sie die Kugeln zweimal mit 1 ml Bead Waschpuffer. Inkubieren Sie die Perlen in 1ml Bead Waschpuffer bei 4 ° zu drehen C für 24 Stunden. Da Bead Waschpuffer enthält humanem AB-Serum, wird es alle Restprotein Bindungsstelle auf die Perlen zu blockieren. Entfernen Sie den Überstand aus Glasflasche, mit 1 ml frisches Bead Waschpuffer zu ersetzen. 2. Qualitätskontrolle von AAPC und Peptid-Beladung, Lagerung Fügen Sie ~ 5 × 10 5 Perlen auf 100 &mgr; FACS-Waschpuffer in FACS-Röhrchen und Fleck mit 1μl der Anti-Maus-IgG1-PE (erkennt den Fc-Teil des HLA-A2-Ig) und 1μl der Anti-Maus-IgG2a-FITC (zu erkennen den Fc-Teil des anti-CD28 mAb). Nach der Färbung für 20 Minuten in FACS-Waschpuffer, wieder waschen und lesen Sie das Färbeergebnis sofort Durchflußzytometer (Abbildung 4). Peptide Verladung auf die Perlen: Waschen Sie die Kugeln zweimal in Glasfläschchen mit 1ml sterile PBS. Resuspendieren mit 1 ml sterilem PBS fügen Sie dann 10 &mgr; l von CMV-Peptid (1mg/ml) Zählen Sie die Perlen durch Hämozytometer und Etikett der Flasche mit Datum und Konzentration. AAPC sind bereit für den Einsatz nach mindestens 3 Tage Peptid Inkubation bei 4 ° C, um genügend Zeit für die Bindung des Peptids auf das HLA-A2-Ig-Dimer zu ermöglichen. Die Perlen können bei 4 ° C gelagert werden und bleiben für mindestens 6 Monate funktionsfähig. 3. Menschliche CTL Isolation Sammeln ~ 100ml frischer peripheren Blut von gesunden HLA-A2 positiven Spender in 10 BD Sodium Heparin Vacutainer-Röhrchen. Verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel oder größer, um eine Hämolyse zu vermeiden. Zentrifuge bei 300xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht durch Aspiration. Das Plasma kann als Ergänzung für das Kulturmedium verwendet werden. Ersetzen Sie das gesammelte Plasma mit sterilem PBS und Transfer das Blut in einem sterilen T75 Kulturflasche oder 50ml konische Röhrchen. Mix das Blut mit PBS gut durch Auf-und Abpipettieren. Nach all dem Blut gesammelt werden, bereiten vier weitere 50ml konische Röhrchen und fügen 15ml Ficoll-Paque Plus. Langsam Overlay 30-35ml von Blutzellen auf der Oberseite des Ficoll jeder Röhre. Halten Sie die Schnittstelle zwischen den verschiedenen Ficoll und Blutzellen. Zentrifugation bei 500 xg für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Schalten Sie die Bremse "off" und die Beschleunigung so gering wie möglich eine klare Schnittstelle zwischen den Schichten zu erhalten. Mit einem seriological Pipette vorsichtig absaugen PBMC-Schicht und sammeln Sie die PBMC in ein frisches 50ml konischen Rohr. Wenn alle PBMC geerntet add 30 ml PBS und Spin bei 400xg für 10 min. Überstand verwerfen und waschen noch einmal mit 30 ml PBS, um alle verbleibenden Ficoll entfernen. Fahren Sie mit CD8 + T-Zell-Isolierung durch Miltenyi menschlichen CD8 + T-Zell-Isolation Kit nach Protokoll des Herstellers. Dieses Kit sehr bereichert für CD8 +-Zellen (in der Regel> 95%) durch Minderung der CD8 – Zellen. Zählen Sie die CD8 + T-Zellen. Die erwartete Reinheit sollte größer sein als 95%. Zu diesem Einsatz 2×10 5 Zellen bestätigen und führen Sie eine CD4/3/8 FACS-Analyse. Die restlichen CTL kann entweder sofort für Antigen-spezifische AAPC Stimulation oder sie können für die zukünftige Verwendung eingefroren werden. 4. In vitro AAPC Basis Kultursystem Bereiten Sie Kulturmediums Für TF (T-Zell-Wachstumsfaktor, im Labor 4 hergestellt) 2X Kulturmedium: komplettem RPMI-Medium plus 5% Spender autologem Plasma und 8% T-Zell-Wachstumsfaktor. <li> Donor autologem Plasma kann durch Hitze-inaktiviertem humanem AB-Serum ersetzt werden. Resuspendieren 1 Million CTL in 8ml von TF 2X Kultur-Medium plus 8ml von kompletten RPMI-Medium, fügen Sie 1 × 10 6 AAPC, gut mischen. Verwenden Sie ein Multi-Channel-Pipette auf den Teller Zellen auf 96 well U unten Zellkulturplatten. (160 ul pro Well) Kultur-Zellen in 37 ° C, 5% CO 2 incubater für 7 Tage. Feed the Zellen an Tag 4 mit 80 ul / well TF 2X Medium. Die Zellen sind bereit, am Tag 7 geerntet werden. Nach der Ernte statt die Zellen vor dem Magneten und entfernen Sie die alte AAPC. Antigen-Spezifität kann durch Tetramer-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden. Phänotyp Färbung und intrazelluläre Zytokin-Färbung sind nach unserer vorherigen Studie 3 durchgeführt. Geernteten Zellen können mit AAPC replattiert wieder unter den gleichen Bedingungen. Zellzahl und Antigen-Spezifität wird erwartet, dass nach wiederholter Stimulation erhöhen. 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für AAPC nach HLA A2-Ig und anti-CD28-Konjugation ist in Abbildung 4 dargestellt. Erfolgreiche Proteinkonjugation ist offensichtlich durch eine deutliche Verschiebung der entsprechenden Antikörper-Färbung. Während die Häufigkeit von CMV-spezifischen CTL im peripheren Blut ist in der Regel 0,5-1%, nach einer Woche von AAPC-vermittelte Stimulation kann die Spezifität zu erreichen 55 bis 93% (Abb. 2 und 3). Die Expansion von Antigen-spezifischen CTL kann sehr variabel zwischen verschiedenen Gebern, aber die Ergebnisse sind reproduzierbar innerhalb des gleichen Spenders. Durch Extrapolation kann der Ausbau der CMV spezifische Zellen Tausende von fache verglichen mit Vorstufe Ebenen direkt ex vivo (Daten nicht gezeigt). Intrazelluläre Zytokin-Färbung (Abbildung 3) zeigt, dass diese erweiterte CTL polyfunktionellen, anstatt erschöpft sind, nach längerer Zellkultur und erhebliche Verbreitung. Abbildung 1. Representative Flussdiagramm AAPC basierte ex vivo Expansion der menschlichen CTL zur adoptiven Immuntherapie bei allogener HSCT Abbildung 2. Representative Tetramer Färbung durch CMV-spezifischen CTL durch AAPC nach einer Woche der Kultur erzeugt Abbildung 3. Representative intrazelluläre Zytokin-Färbung aufgrund der CMV-spezifischen CTL durch AAPC generiert (CMV Spezifität betrug 61%) Abbildung 4. Representative Färbeergebnis der M-450 Epoxy Perlen nach Proteinkonjugation mit Anti-Maus-IgG1-PE und anti-Maus IgG2-FITC gefärbt