Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em
Summary
A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.
Abstract
Sivrisinekler, sarı humma virüsü, sıtma parazitleri ve filarial solucanları gibi hastalığa neden olan patojenleri bir dizi için vektörler. Laboratuvarlar gibi patojenlerin 1, 2 dirençli transgenik sivrisinek üreten umuduyla hastalık vektör türlerinde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin anti-patojen bileşenleri araştırıyoruz. Sivrisinek doğuştan gelen bağışıklık sisteminin savunma 3 birkaç satır oluşur . Epiteli-astarlı sivrisinek midgut 4 dayattığı bariyer kaçmayı patojenlerin hemolimf girin ve dolaşan hemocytes kapsülleyen önemli hücresel bileşenleri ve içine patojenlerin 5, 6 karşılaşma. Araştırmacılar, sivrisinekler hematopoetik dokular için kanıt değildir ve mevcut delil hemocytes sayısı yetişkin ortaya çıkması sabittir ve numaraları aslında sivrisinek yaşları 7 olarak azalabilir göstermektedir. Düzgün bir şekilde toplamak ve tıbben önemli böceklerden hemocytes tespit yeteneği hücresel bağışıklık çalışmaları için önemli bir adımdır. Ancak, sivrisinek, küçük boyutu ve sınırlı hemolimf hacmi bağışıklık hücreleri toplamak için bir meydan okuma oluşturmaktadır.
Sivrisinek hemocytes toplamak için iki yerleşik yöntemlerin bir kesim burnumun 8 hemolimf sürülmesi ve ses hacmi (perfüzyon), tuzlu su, baş ve göğüs (yani, serviks) ve perfüze hemolimf toplanan arasında membranöz necklike bölgeye enjekte edilir karın 9, 10 distal bölgede yırtık bir açılış. Bu teknikler, ancak hemocytes düşük kurtarma ve sırasıyla 11 yağlı vücut hücreleri ile mümkün kirlenme ile sınırlıdır. Kirlenmesine neden olan ölçekler ve iç dokularda 11 seviyelerini azaltırken Daha yakın zamanlarda bir yöntem antikoagülan tamponlarının kullanımı ile immunocytes yüksek enjeksiyon / kurtarma, gelişmiş kurtarma olarak anılacaktır . Bu yöntem geliştirilmiş bir yöntem için birincil kültür hemocytes toplama ve bakımı sağlar, ancak enjeksiyon ve mansap hedefi teşhis için hemocytes, toplamak, düzeltmek ve leke ise gerekli değildir toplama adımları bir dizi gerektirir. Burada, Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon tekniklerinin doğruluğu, salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponlar kullanarak perfüzyon kolaylık getiren sivrisinek hemolimf toplama yöntem göstermektedir.
Protocol
Discussion
Burada açıklanan hemocyte toplama yöntemi değiştirilmiş ve daha önce yayınlanmış yöntemlerden biri daha az adımlarla Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için izin verir . Bizim özel ilgi hemocyte Aedes sivrisinek popülasyonları karakterize yatıyor, biz doğru enjeksiyon hacimlerini belirlemek için ilk denemeler yapıldıktan sonra bu tekniğin diğer sivrisinek gruplarına uygulanabilir inanıyoruz. Bizim protokol salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
John Frey ve Ben Peterson Yazarlar sivrisinek yetiştirme için teşekkür etmek istiyorum. Biz de hemocyte mikrograflar yardım için teşekkür ederim. Christine Davis ve Gary Radice Bu araştırma, Richmond Sanat ve Bilim yaz bursu AA Qayum ve fakülte hibe A. Telang Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) |
Sutter Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
