Cryopreservatie van embryo's Preimplantatie van runderen, schapen, en geiten

1. Het evalueren van geschiktheid van embryo's voor cryopreservatie een Monsters geoogst van de voortplantingsorganen van de individuele donor vrouwelijke moet worden geplaatst in een isotone embryo holding medium voor 10 minuten voor de evaluatie met behulp van een stereomicroscoop. Wees er zeker van om embryo's te houden van elke donor vrouwelijke gescheiden van elkaar om identificatie van de afstamming van embryo transfer nakomelingen mogelijk te maken. Met behulp van een lage vergroting (≤ 10x), specimens van een individuele donor vrouwelijke moeten gescheiden worden in verschillende groepen, bestaande uit onbevruchte eicellen, embryo's ontaarden, of overdraagbaar kwaliteit embryo's. Alleen de kwaliteit graad 1 of 2 embryo's in het compacte morula door middel van uitgebreide blastocyst stadia van ontwikkeling zijn geschikt voor cryopreservatie, en alle andere opties worden verworpen (tenzij de ontvanger synchroon vrouwtjes zijn beschikbaar voor de kwaliteit graad 3 embryo's en een post-overdracht zwangerschap snelheid van ongeveer 25 -30% wordt aanvaardbaar geacht). Inspecteer de kwaliteit van graad 1 en 2 compact morula door middel van uitgebreide blastocyst stadium embryo's bij een vergroting ≥ 50x om ervoor te zorgen dat de zona pellucida van het embryo intact is en dat er geen materiaal (bijvoorbeeld, cellen, slijm) zich te houden aan de zona pellucida. Elke embryo met een gebarsten of ontbrekende zona pellucida of met een zona pellucida met aanhangend materiaal moet worden gescheiden van andere embryo's en ofwel worden vernietigd of afzonderlijk verwerkt. 2. Wassen van embryo's om Waarschijnlijkheid van de overdracht van ziekten 2 Verminder Verplaats zona pellucida-intacte embryo's in een minimaal volume van isotone embryo houden medium in het eerste putje van de embryo wassen medium (bv. fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met antibiotica en bovine serum albumine, pasgeboren kalf serum, of polyvinylalcohol). Te houden embryo's van elke donor vrouwelijke apart, en niet proberen om meer dan 10 embryo's wassen in een keer. Bewegen embryo's in een minimaal volume van medium in elke opeenvolgende wassen om een ​​seriële verdunning ≥ 1:100 bereiken en zeker steriele embryo handling tips die zijn gewijzigd tussen elke opeenvolgende wasbeurt gebruiken. Bewegen embryo's tot en met 4 meer wasbeurten, zoals beschreven in 2.1. Indien de overdracht van virale ziekten is van belang, was embryo's twee keer in een 0,25% trypsine-oplossing, voor een totale gecombineerde blootstelling tijd om trypsine van niet meer dan 90 seconden. Na de twee trypsine wast, wast embryo's vijf keer meer in embryo's wassen medium zoals beschreven in 2.1. Na de laatste embryo te wassen, plaats embryo's in een isotone embryo holding medium. 3. Embryo's drogen Voorafgaand aan Cryopreservatie 3 Embryo's moeten worden overgebracht in een minimaal volume van isotone embryo houden medium in een hypertone oplossing (1.4-1,5 molaire concentratie) van een cryoprotectief middel (CPA), zoals ethyleen glycol of glycerol. Laat embryo's te zitten in de vrieskou medium (hypertone CPA oplossing) totdat ze osmotisch evenwicht. Omdat ethyleenglycol doordringt embryonale cellen sneller dan doet glycerol, evenwicht tijden zijn doorgaans minder voor embryo's in ethyleen glycol (5 min) dan in glycerol (10 min). Een deel van deze equilibratietijd kan worden bereikt tijdens en na de embryo's worden geladen in rietjes (beschreven in de volgende stap). 4. Het laden van embryo's in een 0,25 ml plastic rietje voor Cryopreservatie Bevestig de katoen stekker einde van een 0,25 ml plastic rietje (11,5 cm werklengte) om een ​​embryo het laden van het apparaat, en zuig ongeveer 1,3 cm van hypertone CPA-oplossing in een gemerkte rietje. Een verscheidenheid van de etikettering procedures bestaat, inclusief het gebruik van gedrukte etiketten gevoegd bij een rietje afdichting plug of op een andere stro verbonden met een rietje adapter. Verwijder het stro van de CPA-oplossing, en zuig ongeveer 0,15 cm van de lucht om een ​​kleine luchtbel te creëren binnen het stro. Aspireren een enkel embryo in ongeveer 0,8 cm van hypertone CPA oplossing in het stro. Verwijder het stro van de CPA-oplossing en zuig ongeveer 0,15 cm van de lucht om een ​​tweede kleine luchtbel in het stro (luchtbellen dienen om de embryo fysiek te isoleren binnen het stro) te creëren. Aspireren van ongeveer 9,1 cm van de CPA-oplossing volledig te vullen het stro, de zekerheid te trekken in een voldoende volume van de CPA oplossing voor het polyvinylchloride (PVC) poeder dat bestaat binnen de katoen-stekker van het stro te bevochtigen. De CPA-oplossing zorgt ervoor dat de PVC-poeder om gel en zegel dat uiteinde van het rietje. Seal het andere uiteinde van het rietje met PVC poeder, plastic rietje afdichtpluggen, of een sealmachine. 5. Het plaatsen van embryo's in een gecontroleerde snelheid Embryo Vriezen Machine Ofwel methanol bad of vloeibare stikstof damp invriezen machines kunnen worden geprogrammeerd voor de cryopreservatie van preimplantatie embryo's. Laad de rietjes met de Embry os in een machine waarvan de temperatuur het vriespunt is afgekoeld van kamertemperatuur tot -6 ° C. Laad rietjes katoen plug belanden (tenzij plastic rietje afdichtingspluggen of stro adapters worden gebruikt, in welk geval katoen plug einde is geplaatst naar beneden). Laat embryo's bij deze temperatuur te zitten gedurende minstens 2 minuten voordat u verder gaat. 6. Zaaien Zodra embryo's zijn afgekoeld tot -6 ° C, gebruik dan een tang onderkoelde in vloeibare stikstof (of een wattenstaafje stok ondergedompeld in vloeibare stikstof) om ijs kristalvorming in de CPA oplossing te induceren in het stro door het aanraken van de tang (of katoen getipt stick) naar de kolom van de oplossing boven of onder het embryo. Het water in de CPA-oplossing zal kristalliseren in de regio blootgesteld aan vloeibare stikstof, en ijskristallen zal verspreiden naar de kolom van de CPA oplossing direct rondom de embryo. Houd de embryo's bij het zaaien temperatuur gedurende 10 minuten alvorens verdere koeling. 7. Voortzetting van Uitdroging van embryo's Cool embryo's met een snelheid van 0,5 ° C / min naar beneden tot een temperatuur van -34 ° C. Dit afkoelsnelheid is belangrijk om te zorgen voor de voortdurende uitdroging van het embryo. Houd de embryo's bij -34 ° C gedurende 10 minuten voor het kelderen embryo's in vloeibare stikstof (-196 ° C). Plaats gecryopreserveerde embryo's in een passend label beker (gevuld met vloeibare stikstof), gekoppeld aan een passend label stok, en plaats de stok in een fles met een vloeibare stikstof Dewar voor korte of lange termijn opslag. 8. Ontdooien gecryopreserveerde Embryo's Trek de bus in de hals van de vloeibare stikstof Dewar, ervoor te zorgen dat de bus onder blijft de vorst lijn in de Dewar. Zoek de stok met het embryo te worden ontdooid, en snel en zorgvuldig het stro uit de beker, die zeker niet aan andere rietjes warm in de beker. Houd het rietje in de lucht voor 3-5 seconden (om de incidentie van een gebarsten zona pellucida 4 verminderen), en vervolgens ondergedompeld in een 37 ° C waterbad voor een extra 25-30 seconden. Verwijder het stro van het waterbad, veeg het stro (en let niet op de embryo identificatie vlekken op het stro), gebruik dan een rietje snij-apparaat afsnijden van de niet-katoen stekker van de stro (indien verzegeld met behulp van warmte of PVC-poeder ), of verwijder voorzichtig de plastic afsluitdop, en ofwel: laden het stro in een embryotransfer apparaat en overdracht zo snel mogelijk aan een synchrone embryo ontvanger (maar alleen als het embryo was gecryopreserveerde met behulp van ethyleen glycol als de CPA), of Houd het open uiteinde van het rietje meer dan een schotel met een 1,0 molaire concentratie van sucrose (een niet-doordringende verbinding), en gebruik een schaar af te snijden van de katoen stekker van het stro. Inhoud van het stro moet vrij kunnen stromen in de sucrose oplossing, maar indrukken van een klein kolom van lucht door het rietje kan nodig zijn als alle resten van het medium bestaat in het stro. Laat embryo's in sucrose oplossing blijft gedurende 10 minuten, en vervolgens over embryo's in een isotone embryo holding medium voor 10 minuten. Evalueer embryo's na ontdooien, te laden in een nieuw stro, en transfer naar geschikte ontvanger vrouwen. 9. Representatieve resultaten: Een verscheidenheid aan factoren kan invloed hebben op de zwangerschap en de live-geboortecijfer als gevolg van de overdracht van de ingevroren-ontdooide pre-implantatie embryo's synchrone ontvanger vrouwen 5. Embryo's in ontwikkelingsfasen minder ver gevorderd dan compact morula of meer geavanceerd dan uitgebreid blastocyst vaak niet overleven de cryopreservatie proces alsook embryo's in het compacte morula, vroege blastocyst, blastocyst, en breidde blastocyst stadium van de embryonale ontwikkeling. Embryo's van kwaliteitsklasse 1 en 2 geven een hogere post-dooi zwangerschap tarieven dan wel de kwaliteit graad 3 embryo's (die meestal niet gecryopreserveerd vanwege de lage post-dooi zwangerschap tarieven). Embryo's mishandeld tijdens de embryo bevriezing of embryo ontdooien procedures waarschijnlijk verminderd zwangerschap tarieven vertonen. Embryo's aan ontvanger vrouwen wier oestrische cycli worden niet gesynchroniseerd met die van de donor vrouwelijke typisch produceren lagere kans op zwangerschap tarieven. Embryo's in vitro of gemanipuleerd in een of andere manier (bijvoorbeeld biopsie of doorsneden) meestal opbrengst lagere kans op zwangerschap tarieven. Onder optimale omstandigheden, zwangerschap tarieven verkregen na de overdracht van ingevroren en ontdooid in vivo verkregen embryo's is meestal 60-70% in vee 6,7, 65-75% bij schapen 8,9,10,11, en ​​60-70% bij geiten 12,13,14,15. Ook de zwangerschap tarieven verkregen na de overdracht van ingevroren en ontdooid in vitro geproduceerde embryo's is meestal 40-50% bij runderen 6,16, 25-35% bij schapen 17, en 30-40% bij geiten 18. BLE 1 "/> Tabel 1. Verwachte percentage zwangerschappen na de overdracht van ingevroren en ontdooid embryo's van herkauwers binnen diersoorten te synchrone ontvanger vrouwen.