Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

1. Método MCAO Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional y los Comités de Uso de la UCSF y la Universidad Estatal de Kent, y se rige por los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de experimentación. Cortar una sutura monofilamento 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) en 20 segmentos mm. Alrededor de la punta de cada segmento por calentamiento cerca de un cauterizador (Braintree Scientific, Inc., Boston, MA). Mida el diámetro de la punta con un micrómetro (Applied Image Inc., Rochester, NY). Nosotros utilizamos una sutura con un diámetro de la punta final de 0,21-0,22 mm para un ratón con el peso corporal de 25 a 30 g. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, durante 15 minutos). Desinfectar la mesa de cirugía y el equipo asociado con etanol al 70%. Anestesiar a un 8-12 semanas de edad del ratón (25-30 g) con 5% de isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) en el 30% O 2 / 70% N 2 O con el sistema V-10 Anestesia (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Después de la inducción de la anestesia, reducir el nivel de isoflurano y mantenerlo en el 1,5%. Coloque el ratón en la posición en decúbito supino sobre una almohadilla térmica. Insertar una sonda rectal, y vigilar y mantener la temperatura corporal entre 36,5 a 37,5 ° C con el TR-200 sistema de temperatura homeotermos (Fine Ciencia Tools Inc., Foster City, CA). Afeitarse la piel en la región del cuello ventral con una maquinilla eléctrica (Braintree Científica) para exponer la piel. La desinfección de la zona quirúrgica con tres aplicaciones de etanol al 70%. Bajo un microscopio estéreo de disección (Nikon, Japón), haga una incisión de 1 cm de largo la línea media del cuello. Utilice separadores (Braintree Scientific) para exponer el campo quirúrgico e identificar la arteria carótida común (CCA), arteria carótida externa (ACE), y la arteria carótida interna (ICA). Diseccionar cuidadosamente las arterias libres de alrededor de los nervios y la fascia. Diseccionar la ECA más distal y la coagulación de la ECA y su arteria tiroidea superior (STA) rama con un coagulador bipolar (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Cortar la CEPA y la STA en el segmento de coagulación. Vagamente eliminatoria a doble 8-0 suturas de seda alrededor del muñón ECA. Aplique una pinza vascular (Herramientas de Bellas Ciencia) en la bifurcación de la CCA en el Tribunal de Cuentas y de la ACI. Haga una pequeña incisión en el extremo de la CEPA muñón con unas tijeras de primavera Vannas estilo (Herramientas de Bellas Ciencia). Medir y registrar la duración de una sutura monofilamento 5-0 redondeadas en la punta. Inserte la sutura en la incisión y avanzar a la abrazadera. Apriete los dos puntos de seda alrededor de la luz lo suficiente como para asegurar al mismo tiempo preservar la movilidad de la sutura monofilamento en vivienda. Retire la abrazadera de la bifurcación. Suavemente avanzar en la sutura de monofilamento de la luz de la ECA en el ICA para una distancia de 9.10 mm más allá de la bifurcación de la CCA para ocluir el origen de la MCA. La duración de la cirugía es de aproximadamente 30-45 min. Sutura de la incisión en el cuello y coloque el ratón en una caja de 35 ° C de enfermería para recuperarse de la anestesia, y devolverlo a la jaula. Generalmente se tarda 5-10 minutos para los ratones a recuperarse de la anestesia. Para llevar a cabo MCAO transitorios, el investigador puede volver a anestesiar el ratón y retirar la sutura de nuevo en el tronco de la CEPA después de un período de tiempo, generalmente entre 0,5 a 2 h. Veinticuatro horas después de la inducción de MCAO, anestesiar el ratón con isoflurano 5% y la eutanasia por dislocación cervical. Decapitar el ratón y recoger el cerebro. Cortar el cerebro coronal en cuatro rodajas de 2 mm con una matriz de cerebro (Braintree Scientific) en el hielo. Se incuban las rodajas de cerebro en el 2% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) (Sigma-Aldrich) en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente para determinar el tamaño y la extensión del infarto. Fijar las rodajas de cerebro en el 10% neutral solución de formalina tamponada (Sigma-Aldrich) a 4 ° C hasta que la imagen. La extensión del infarto se puede cuantificar como se describe en el protocolo JoVe 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. Resultados representante Los infartos generados por MCAO se ven en el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral. El estriado es más sensible a la isquemia de la corteza cerebral. Treinta minutos de MCAO producirá un infarto sólo en el cuerpo estriado, mientras que más de una hora de MCAO dañar tanto el cuerpo estriado y la corteza. Después de 24 h MCAO permanente, el porcentaje total de infarto es de ~ 40 ± 5% del hemisferio y la tasa de mortalidad después de la cirugía es de alrededor del 10%. Se excluye a los ratones de más estudios, si se produce un sangrado excesivo durante la cirugía, el tiempo de funcionamiento supera los 90 minutos, los ratones no recuperarse de la anestesia en los 15 minutos, o la hemorragia se encuentra en las secciones de cerebro o en la base del círculo de Willis durante el examen post-mortem . jove_content "> Figura 1. Imágenes representativas de las secciones de cerebro TTC-manchada (nivel coronal 1-4) después de 24 h de MCAO permanente. En el tejido vivo TTC es enzimáticamente reducido por deshidrogenasas de 1,3,5-triphenylformazan (TPF), que es de color rojo, mientras que en las áreas necróticas sigue siendo blanco debido a la ausencia de actividad enzimática tales. Por lo tanto, el área de infarto se puede identificar por su color blanco debido a la falta de conversión de TTC para TPF. Nota: TTC es un tanto calor y la luz inestable para proteger a las secciones teñidas de luz y calor tanto como sea posible.