Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

1. Método MCAO Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Comitês Use em UCSF e Kent State University, e age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais experimentais. Cortar uma sutura de monofilamento 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) em 20 segmentos mm. Rodada na ponta de cada segmento, por aquecimento, perto de um cauterizador (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA). Medir o diâmetro da ponta usando um micrômetro (Applied Image Inc., Rochester, NY). Usamos uma sutura com um diâmetro da ponta final de 0,21-0,22 mm para um mouse com peso corporal de 25-30 g. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos por autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, por 15 min). Higienizar a mesa de cirurgia e equipamentos associados que utilizam etanol 70%. Anestesiar um rato 8-12 semanas de idade (25-30 g) com 5% de isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) em 30% O 2 / 70% N 2 O usando o sistema V-10 Anestesia (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Após a indução da anestesia, reduzir o nível de isoflurano e mantê-la em 1,5%. Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada de aquecimento. Introduza uma sonda retal, e monitorar e manter a temperatura corporal entre 36,5-37,5 ° C usando o TR-200 do sistema de temperatura homeotérmicos (Fine Ciência Tools Inc., Foster City, CA). Raspar o pêlo na região do pescoço ventral com tosquiadeiras elétricas (Braintree Científica) para expor a pele. Desinfectar o local da cirurgia por meio de três aplicações de etanol 70%. Sob um microscópio estéreo de dissecação (Nikon, Japão), fazer uma incisão longa um centímetro da linha média do pescoço. Use retratores (Braintree Científica) para expor o campo cirúrgico e identificar a artéria carótida comum direita (CCA), artéria carótida externa (ACE), e da artéria carótida interna (ACI). Dissecar cuidadosamente as artérias livres de ao redor dos nervos e fáscias. Dissecar o ECA ainda mais distalmente e coagular o ECA e sua artéria tireoidiana superior ramo (STA) utilizando um coagulador bipolar (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Corte o ECA e STA no segmento coagulado. Vagamente empate 8-0 duas suturas de seda ao redor do coto ECA. Aplicar uma pinça vascular (Ferramentas Ciência Fine) na bifurcação da CCA para a ECA e ICA. Fazer uma pequena incisão no final da ECA toco com uma tesoura Vannas estilo de mola (Ferramentas Ciência Fine). Medir e registrar o comprimento de uma sutura de monofilamento 5-0 arredondadas na ponta. Inserir a sutura na incisão e avançar para o grampo. Aperte os dois fio de seda ao redor do lume apenas o suficiente para preservar a mobilidade segura e da sutura de monofilamento na habitação. Retire o grampo da bifurcação. Suavemente antecedência a sutura de monofilamento do lúmen do ECA no ICA por uma distância de 9-10 mm além da bifurcação da CCA para ocluir a origem do MCA. A duração da cirurgia é de cerca de 30-45 min. Suturar a incisão no pescoço e coloque o mouse em uma caixa de 35 ° C de enfermagem para se recuperar da anestesia, e devolvê-lo para a jaula. Geralmente leva 50-10 min para os ratos a recuperar da anestesia. Para executar MCAO transitória, o pesquisador pode re-anestesiar o rato e retirar a sutura de volta para o coto do ECA, após um período de tempo, geralmente entre 0,5-2 h. Vinte e quatro horas após a indução da MCAO, anestesiar o rato com 5% de isoflurano e sacrificá-lo por deslocamento cervical. Decapitar o mouse e recolher o cérebro. Fatia do cérebro coronariamente em quatro fatias de 2 mm com uma matriz cérebro (Braintree Científica) no gelo. Incubar as fatias de cérebro em 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (Sigma-Aldrich) em 1X PBS por 20 min em temperatura ambiente para determinar o tamanho ea extensão do infarto. Corrigir as fatias de cérebro em 10% neutra tamponada de formalina (Sigma-Aldrich) a 4 ° C até de imagem. A extensão do infarto pode ser quantificado, conforme descrito no protocolo JOVE 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. Resultados representante Os infartos gerada pelo MCAO são vistos no estriado e do córtex dorsolateral. O striatum é mais sensível à isquemia do que o córtex cerebral. Trinta minutos de MCAO irá produzir apenas um infarto no corpo estriado, enquanto que mais de uma hora de MCAO irá danificar o estriado e córtex. Após 24 h MCAO permanente, o percentual total de infarto é de aproximadamente 40 ± 5% do hemisfério ea taxa de mortalidade após a cirurgia é de aproximadamente 10%. Excluímos ratos a partir de estudos ainda se ocorre sangramento excessivo durante a cirurgia, o tempo de operação superior a 90 min, os ratos não conseguem se recuperar da anestesia dentro de 15 min, ou hemorragia é encontrado no cérebro ou fatias na base do círculo de Willis durante o exame post-mortem . jove_content "> Figura 1. Imagens representativas de fatias TTC-manchada cérebro (nível coronal 1-4) após 24 h de MCAO permanente. Em tecidos vivos TTC é enzimaticamente reduzido em desidrogenases a 1,3,5-triphenylformazan (TPF), que é de cor vermelha, enquanto em áreas necróticas permanece branca devido à ausência de atividade enzimática tal. Portanto, a área de infarto podem ser identificados por sua cor branca, devido à falta de conversão de TTC para TPF. Nota: TTC é um pouco de calor e luz instável para proteger cortes corados do calor e da luz, tanto quanto possível.