עכבר דגם ספיגה התיכון עורק מוחי

1. שיטת MCAO פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השתמש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ו קנט סטייט, ולאחר פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה. גזור תפר 5-0 monofilament (הרווארד Apparatus, Holliston, MA) לתוך 20 קטעים מ"מ. סיבוב קצה של כל פלח ידי חימום זה ליד cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA). מדוד את הקוטר של קצה באמצעות מיקרומטר (יישומי Image Inc, רוצ'סטר, ניו יורק). אנו משתמשים תפר בקוטר קצה הסופי של 0.21-0.22 מ"מ עבור עכבר עם משקל גוף של 25-30 גרם לעקר את כל כלי הניתוח על ידי מעוקר (מינימום 121 ° C, 15 PSI, במשך 15 דקות). לטהר את שולחן הניתוח וציוד נלווה באמצעות אתנול 70%. הרדימי 8-12 בן שבוע העכבר (25-30 גרם) עם 5% isoflurane (Aerrane, בקסטר, Deerfield, IL) ב 30% O 2 / 70% N 2 O באמצעות מערכת ה-V-10 הרדמה (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להפחית את רמת isoflurane ולתחזק אותו 1.5%. מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על משטח חימום. הכנס בדיקה רקטלית, לפקח ולשמור על טמפרטורת הגוף בין 36.5-37.5 מעלות צלזיוס באמצעות TR-200 המערכת טמפרטורה homeothermic (Fine המדע כלים בע"מ, פוסטר סיטי, קליפורניה). לגלח את הפרווה שעל באזור הצוואר הגחון עם קוצץ חשמלי (Braintree Scientific) כדי לחשוף את העור. לחטא את האתר כירורגית באמצעות שלושה יישומים של אתנול 70%. תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו (ניקון, יפן), לעשות 1 ס"מ חתך קו האמצע ארוך על הצוואר. השתמש retractors (Braintree Scientific) כדי לחשוף את שדה הניתוח ולזהות את עורק התרדמה המשותף הימני (CCA), חיצוני העורק הראשי (ECA), ו פנימי העורק הראשי (רשפ"ת). בזהירות לנתח את העורקים ללא שמסביב עצבים fascia. מנתחים את ECA נוסף distally ו להקריש ECA ו עורק התריס מעולה (STA) הסניף באמצעות coagulator דו קוטבית (הווארד כלי Inc, Tuscaloosa, א.ל.). חותכים את ECA ו STA בכל מגזר קרוש. Loosely קושרים שתי 8-0 תפרים משי סביב הגדם ECA. החל מהדק וסקולרית (כלי מדעי פיין) בשעה הסתעפות של המרכז לאמנות עכשווית לתוך ECA ו ICA. לעשות חתך קטן בסוף ECA גדם עם Vannas בסגנון מספריים באביב (כלים המדע פיין). מדוד ורשום את אורך תפר 5-0 monofilament מעוגלים בקצה. הכנס את תפר את החתך ולהתקדם מהדק. הדקו את שני התפרים משי סביב לומן מספיק כדי לאבטח עדיין לשמר הניידות של תפר ב-המגורים monofilament. הסר את מהדק מ הסתעפות. בעדינות לקדם את תפר monofilament מ לומן של ECA לתוך ICA למרחק של 9-10 מ"מ מעבר הסתעפות של המרכז לאמנות עכשווית כדי לחסום את המקור של MCA. משך הניתוח הוא כ – 30-45 דקות. תפר את החתך על הצוואר במקום עכבר בתיבת 35 ° C סיעוד להתאושש מן ההרדמה, ולהחזיר אותו לכלוב. זה בדרך כלל לוקח 50-10 דקות עבור העכברים כדי להתאושש מן ההרדמה. כדי לבצע MCAO חולף, החוקר יכול להרדים מחדש את העכבר למשוך את תפר בחזרה גדם של ECA לאחר תקופה מסוימת, בדרך כלל בין 0.5-2 ח עשרים וארבע שעות לאחר גיוס של MCAO, להרדים את העכבר עם 5% ו isoflurane להרדים אותו על ידי נקע בצוואר הרחם. לערוף את העכבר לאסוף את המוח. פורסים את המוח coronally לארבע פרוסות 2 מ"מ עם מטריצה ​​המוח (Braintree Scientific) על קרח. דגירה את פרוסות המוח 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (סיגמא אולדריץ ') ב 1X PBS עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לקבוע את הגודל וההיקף של אוטם. תקן את פרוסות המוח ב -10% ניטרלית שנאגרו פתרון פורמלין (סיגמא אולדריץ ') בשעה 4 ° C עד הדמיה. היקף אוטם ניתן לכמת כמתואר יופיטר פרוטוקול 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. נציג תוצאות אוטמים שנוצר על ידי MCAO נראים בסטריאטום ואת קליפת דורסולטרלי. הסטריאטום הוא רגיש יותר לאיסכמיה מאשר בקליפת המוח. שלושים דקות של MCAO יפיק האוטם רק בסטריאטום, בעוד יותר משעה של MCAO יפגע הן הסטריאטום ואת קליפת המוח. לאחר 24 שעות MCAO קבוע, אחוז האוטם הכולל הוא ~ 40 ± 5% בחצי הכדור ואת שיעור התמותה לאחר הניתוח הוא ~ 10%. אנו לא כוללים עכברים ממחקרים נוספים אם דימום יתר מתרחשת במהלך הניתוח, את זמן הניתוח עולה על 90 דקות, עכברים מצליחים להתאושש מן ההרדמה בתוך 15 דקות, או דימום נמצא את פרוסות המוח או בבסיס המעגל של ויליס במהלך הבדיקה שלאחר המוות . 61/2761fig1.jpg "alt =" איור 1 "/> באיור 1. נציג תמונות של TTC מוכתם פרוסות המוח (רמת העטרה 1-4) לאחר 24 שעות של MCAO קבע. בכל רקמה חיה TTC הוא מופחת על ידי enzymatically dehydrogenases ל 1,3,5-triphenylformazan (TPF), שבו הוא בצבע אדום, ואילו באזורים נמקי הוא נשאר לבן בשל היעדר הפעילות האנזימטית כאלה. לכן, בתחום של אוטם ניתן לזהות לפי צבע לבן שלה בשל חוסר ההמרה של TTC כדי TPF. הערה: TTC הוא חום מעט אור לא יציב כל כך להגן על החלקים המוכתמים מהחום והאור כמה שיותר.