Muis model van de midden cerebrale slagader Occlusion

1. MCAO Methode Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies bij UCSF en Kent State University, en houdt zich aan de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren. Snijd een 5-0 monofilament hechtmateriaal (Harvard Apparatuur, Holliston, MA) in 20 mm segmenten. Rond het uiteinde van elk segment door het te verhitten bij een cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA). Meet de diameter van de tip met behulp van een micrometer (Applied Image Inc, Rochester, NY). We maken gebruik van een hechtdraad met een laatste tip diameter van 0,21-0,22 mm voor een muis met een lichaamsgewicht van 25-30 g. Steriliseer alle chirurgische instrumenten in autoclaaf (minimum 121 ° C, 15 PSI, gedurende 15 min). Ontsmetten van de operatie tafel en de bijbehorende apparatuur met 70% ethanol. Verdoven een 8-12 weken oude muizen (25-30 g) met 5% isofluraan (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) in 30% O 2 / 70% N 2 O met behulp van de V-10 Anesthesie-systeem (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Na de inductie van de anesthesie, verminderen het niveau van de isofluraan en onderhouden op 1,5%. Plaats de muis in de rugligging op een verwarmingselement. Plaats een rectale sonde, en monitoren en onderhouden van de lichaamstemperatuur tussen de 36,5-37,5 ° C met behulp van de TR-200 homeothermic temperatuur systeem (Fine Science Tools Inc, Foster City, CA). Scheren van de vacht op de buik nek regio met tondeuse (Braintree Scientific) op de huid bloot te leggen. Desinfecteer de operatiewond met behulp van drie toepassingen van 70% ethanol. Onder een stereo-installatie dissectiemicroscoop (Nikon, Japan), maak een 1 cm lange middellijn incisie op de hals. Gebruik oprolmechanismen (Braintree Scientific) om het chirurgische veld bloot te leggen en het recht gemeenschappelijke halsslagader (CCA), externe halsslagader (ECA), en de interne halsslagader (ICA) te identificeren. Zorgvuldig ontleden de slagaders vrij uit de omliggende zenuwen en fascia. Ontleden van de Rekenkamer verder distaal en stollen de Europese Rekenkamer en zijn superieure schildklier slagader (STA) tak met behulp van een bipolaire coagulator (Howard Instrument Inc, Tuscaloosa, AL). Snijd de Rekenkamer en de STA aan de gestolde segment. Losjes gelijkspel 8-0 twee zijden hechtingen rond de Europese Rekenkamer stomp. Breng een vasculaire klem (Fine Science Tools) op de splitsing van de CCA in de Europese Rekenkamer en de ICA. Maak een kleine incisie aan het einde van de Europese Rekenkamer stronk met Vannas-stijl veer schaar (Fine Science Tools). Meet en noteer de lengte van een 5-0 monofilament hechting afgerond aan het uiteinde. Steek de hechting in de incisie en vooraf aan de klem. Draai de twee zijden hechtingen rond het lumen net genoeg om veilig maar toch behouden mobiliteit van de in-woning monofilament hechtmateriaal. Verwijder de klem van de bifurcatie. Voorzichtig vooraf het monofilament hechtdraad uit het lumen van de Europese Rekenkamer in de ICA over een afstand van 9-10 mm voorbij de splitsing van CCA om de oorsprong van MCA af te sluiten. De duur van de operatie is ongeveer 30-45 minuten. Suture de incisie op de hals en zet de muis in een 35 ° C verpleging box om te herstellen van anesthesie, en terug in de kooi. Het duurt over het algemeen 5-10 min voor de muizen om te herstellen van anesthesie. Voor het uitvoeren van voorbijgaande MCAO, kan de onderzoeker opnieuw verdoven met de muis en terug te trekken van de hechting in de stronk van de Europese Rekenkamer na een periode van tijd, meestal tussen de 0,5-2 uur Vierentwintig uur na de inductie van MCAO, verdoven van de muis met 5% isofluraan en euthanaseren door cervicale dislocatie. Onthoofden de muis en het verzamelen van de hersenen. Coronaalwaarts Snijd de hersenen in vier 2-mm schijven met een brein matrix (Braintree Scientific) op ijs. Incubeer de hersenen plakjes in 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) (Sigma-Aldrich) in 1X PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur om de grootte en de omvang van het infarct te bepalen. Bevestig de hersenen plakjes in 10% neutraal formaline oplossing (Sigma-Aldrich) gebufferde bij 4 ° C tot beeldvorming. De mate van infarct kan worden gekwantificeerd, zoals beschreven in Jupiter-protocol 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9. 2. Representatieve resultaten De infarcten gegenereerd door MCAO worden gezien in het striatum en de dorsolaterale cortex. Het striatum is meer gevoelig voor ischemie dan de cerebrale cortex. Dertig minuten van MCAO zal produceren een infarct alleen in het striatum, terwijl meer dan een uur van de MCAO zal zowel striatum en cortex schade. Na 24 uur permanent MCAO, het totale percentage infarct is ~ 40 ± 5% van het halfrond en de mortaliteit na de operatie is ~ 10%. We sluiten muizen van verdere studies of overmatig bloeden optreedt tijdens de operatie, de operatie tijd 90 min overschrijdt, muizen niet om te herstellen van anesthesie binnen 15 min, of bloeding is gevonden in de hersenen schijfjes of aan de basis van de cirkel van Willis tijdens de post mortem onderzoek . 61/2761fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/> Figuur 1. Representatieve beelden van TTC-gekleurde hersenen plakjes (coronale niveau 1-4) na 24 uur van permanente MCAO. In levend weefsel TTC wordt enzymatisch verminderd door dehydrogenases aan 1,3,5-triphenylformazan (TPF), dat is rood van kleur, terwijl het in necrotische gebieden blijft wit door het ontbreken van een dergelijke enzymatische activiteit. Daarom kan het gebied van het infarct worden geïdentificeerd door zijn witte kleur door een gebrek aan omzetting van TTC aan TPF. Let op: TTC is een beetje warmte en licht onstabiel dus bescherm gekleurde coupes van warmte en licht zoveel mogelijk.