Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction
Summary
Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.
Abstract
Presinaptik embriyonik gelişim sırasında, nöronal süreçler, büyüme koni aracılığıyla hedeflerine ulaşmak için kısa mesafelerde hareket. Zamanla, nöronal somata nedeniyle iskelet büyütme organizmanın büyüme (. Gri, Hukkanen ve ark 1992 Weiss 1941) akson terminallerinin ayrılır. Bu mechanotransduction indükler akson sürekli uzama uyum yeteneğine nöronal büyüme ikincil bir mod (Bray 1984; Heidemann ve Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux ve ark 1995, Pfister, Iwata ve ark 2004).
Akson Streç Büyüme (ASG) makul uzun sinirler ve yetişkin sinir sisteminin karakteristik beyaz cevher yollarında kısa embriyonik süreçlerin olgunlaşması merkezi bir faktördür. In vitro ASG çalışma için, biyoreaktörler nöronal kültürlerin kısa aksonal süreçler (Loverde, Ozoka ve ark 2011) gerilim uygulamak için tasarlanmış. Burada, ayrıntılı biyoreaktörler hazırlamak ve ASG yürütmek için kullandıkları yöntemleri. İlk olarak, biyoreaktör her uzanan şerit içinde, nöronlar, bir mikro-manipüle çekme substrat üzerine kaplanmıştır. Sonra, nöronlar sabit bir yüzey üzerine, büyüme konisinin uzantısı ile, onların aksonal süreçleri yeniden. Son olarak, streç büyüme, sabit bir yüzeye yapıştırılır akson terminalleri kaplama hücre gövdeleri uzaklıkta çekme yapılır; büyüme konisinin uzantısı sonra iskelet büyüme yansıtan.
Önceki iş uzunlukları 10cm kadar ulaşan, embriyonik sıçan dorsal kök gangliyon nöronları ASG 10mm/day için eşi görülmemiş büyüme oranları kadar yetenekli olduğunu gösterdi, eş zamanlı olarak artan aksonal çaplarda (Smith, Wolf ve ark 2001, Pfister, Iwata ve ark 2004; Pfister, Bonislawski ve ark 2006, Pfister, Iwata ve ark 2006; Smith 2009). Bu rejeneratif büyüme konisinin uzantısı (mekanik uyaranların yokluğunda) büyüme oranları ile ortalama 1mm/day uzunlukları 3cm daha az sınırlı başarılı rejenerasyon (. Pfister, Gordon ve ark 2011 Fu ve Gordon 1997) dramatik bir zıtlık Buna göre, daha fazla çalışma ASG mekanik uyaranların yokluğunda rejenerasyon sınırı düzensiz büyüme mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir.
Protocol
Discussion
İki kritik adımlar biyoreaktörlerin hazırlanması sırasında dikkat edilmelidir. İlk olarak, substrat arayüzü optimal bir örtüşme aksonlar sabit bir yüzey üzerine çapraz sağlamak için gerekli. Aşırı kıvrılmış veya başka bir şekilde kusurlu Aclar (Şekil 3) kullanılmamalıdır. Örtüşme optimize etmek için, çekme substrat 2-3mm uzun temas üzerinden sabit zemin düzgün eşit zımparalanmış ve rehber olduğunu onaylayın. Üst üste çekme bacaklar yüksekliği dikkatlice ayarlayarak her deney öncesinde optimize edilmelidir.
İkincisi, nöronların tutturulması için sağlarken, substrat boyalar aksonlar (Pfister, Iwata ve ark, 2004;. Loverde, Ozoka ve ark 2011 Heidemann ve Buxbaum 1990) biyoreaktör ve kontraktil gerginlik değiştirmesinden kaynaklanan önemli Sheering güçlerine dayanma. Substratlar lisin kaplama öncesinde ve sonrasında her iki steril su ile iyice durulanması gerekir. Kaplamalar taze çözülmüş alikotları uygulanan ve mümkün olduğu kadar eşit bir şekilde yayılmış olmalıdır. Yüzeylerde yapışma döneminde önemlisi, hareket ettirilebilir olmamalı veya başka bir şekilde rahatsız. Bir sonraki adımda, kaplama sırasında substratlar ile temasından kaçınmak ve şeritlerinin substrat arayüzü uzak uzak sonundan itibaren tüm çözümler pipetlemeyin.
Her biyoreaktör bileşeni bağlantıları toleranslar bolluk şeklinde tezahür edebilir. Otomatik doğrusal hareket tablosu hareketi çekme blok hareketi olmadan oluşur ASG ilk dönemde, sistem bolluk açıktır. Slack Deneme başına değişir, ancak bizim deneyim genellikle <1mm. Bu nedenle, bir "ön-gerilim" 1mm/day, gevşek eliminasyon fazı, bir gün, biyoreaktör parçalar çekme yüzeylerde hareketi sırasında meşgul ve başlamak ASG program önce gelir.
Otomatik doğrusal hareket tablosu yerinden adım öncesi gerginlik aşamasından sonra çekme blok yerinden eşleşmiyorsa Sorun Giderme gerekebilir tamamlandı. , Çekme blok Asenkron, yanlış değiştirmeler 'stiction' ya da statik sürtünme ve çekme donanım içinde adaptörün esneme ile ilişkilidir. Meydana gelen bu sorunları önlemek için, çekme blok hareketi pürüzsüz yakın zahmetsiz hareketi için, montajdan sonra, el ile kontrol edilmelidir. Bağlama oluşursa, çekme montaj deneye önce serbest olmalıdır. Adaptörün yeterli sertliği de çekme donanım stiction üstesinden gelmek değildir, doğru, eş zamanlı değiştirmeler sağlamak için gerekli.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NSF KARİYER CBET-0747615 tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. , Rehberlik ve destek için Douglas H. Smith ve David F. Meaney.
Materials
| Name of component | Company | Catalogue number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD, Bedford, MA | 354210 |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O’Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
