Axon Stretch Рост: механотрансдукции нейронных рост

1. Обзор Рост Axon система биореактора Stretch Два преобладают подходы были использованы для экспериментального применения силы для нейронов. В рамках первого подхода, силы применяется ко всему нейрону (Lu, Franze и др. 2006;. Chetta, Ге и др., 2010;.. Линдквист, Лю и др., 2010). При втором подходе, силы применяются непосредственно к аксону, потянув за роста конуса. Использование стекла иглы, этот последний подход был использован для моделирования формирования новых аксонов (Берналь, Pullarkat и др. 2007;. О'Тул, Ламуре и др. 2008;.. Ламуре, Heidemann и др. 2010), для определения силы пороги для удлинения и втягивание (Dennerll, Ламуре и др., 1989;. Чжэн, Ламуре и др., 1991;.. Ламуре, Чжэн и др. 1992), а также проанализировать нейромедиатора кластеризации в аксонов терминалов (Siechen, Ян и др. 2009 год.). Единственное расширение тканевой инженерии этого метода была разработана с целью получения больших нервов конструкций с использованием автоматизированной Рост Stretch Аксон (ПГС) биореактор система (Iwata, Браун и др., 2006;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Недавно мы разработали миниатюрные версии биореактор система для изучения ПГС микроскопически в реальном времени (Loverde, Ozoka и соавт. 2011). Здесь мы подробно 9-дневной протокол (таблица 1) мы в настоящее время использовать для подготовки биореакторов и выполнять ПГС в установленном порядке. Общее описание: ПГС биореактор система состоит из трех основных компонентов, 1) биореактор камеры с независимой полосы движения (удлиненные скважин), где нейроны культивировались и потянулся, 2) автоматизированных линейной таблицы движения применить растягивающих сил и 3) шагового двигателя контроллер диска с программным обеспечением для управления растянуть роста (рис. 1). Короче говоря, изготовление прототипов биореактор был выполнен в механический цех использованием вертикальный фрезерный станок (Бриджпорт, Эльмира, Нью-Йорк). Для биосовместимость, простота стерилизации и долговечность, внутренние компоненты биореактора были изготовлены из 3 / 8 "полиэфирэфиркетона (PEEK). Прозрачный поликарбонат был использован для крышек для обеспечения световой микроскопии и просмотра культур. Коррозионностойкие из нержавеющей стали 316 винтов и аппаратного обеспечения полной собрание (McMaster-Карр, Элмхерст, Иллинойс). Камеру биореактора состоит из пялец, что формы 3 полосы движения, регулируемые буксировки блок, который манипулирует клеток через переулки, и выступающие буксировки стержни для внешних манипуляций (рис. 2). Нейронов культуры высевали на одноразовые Aclar культуры субстратов буксировки поддерживается блок буксировки (рис. 2 и 3). Одноразовые покровное стационарных подложки придает нижней части пялец и охватывает все 3 полосы движения. До растяжения, с гальваническим нейроны должны расширить аксонального процессы от буксировки подложки на подложке с помощью стационарных роста расширение конуса. Население аксонов, что мост субстратов впоследствии пройти растянуть, контролируя перемещение буксировки блок. Автоматизированных линейной таблицы движения состоит из шагового двигателя (HT23-397, прикладной движения Продукты, Watsonville, CA) и линейные таблицы движения (MIPS-2-10-1.0мм, Servo Systems, Монтевилл, Нью-Джерси), установленный в таблице выравнивание Delrin . Камеру биореактора сидит в таблице параллельно линейной таблицы движения. Буксировки стержней простирается от биореактора камеры крепятся к линейной таблицы движения с помощью адаптера. Шаговым двигателем контроллер диска (Si 2035, прикладной Продукты Motion) программируется с помощью входящего в Si программист программного обеспечения для управления манипуляции субстратов буксировки. Аксонального растянуть применяется в поэтапно путем принятия ряда малых шагов перемещения расположенных по времени выдержки (Пфистер, Ивата и др., 2004;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Этот компьютер-управляемая система предоставляет возможность запрограммировать индивидуальные профили для ПГС, и имеет важное значение для непрерывного эксперимента в течение нескольких дней до нескольких недель. 2. Подготовка биореактора палаты Подготовка одноразовые буксировки и стационарных культуры субстраты для нейронов культуры: Субстратов Буксировка культуры вырезаны из 8,5 "х 11" листов Aclar пленки (33C 2,0 млн., структура Probe, Уэст-Честер, штат Пенсильвания). Используя острый разрезанию подложки примерно 0,5 х 2,5 см, или чуть меньше, чем ширина полосы, чтобы по крайней мере 1-2мм просвет с обеих сторон. Слегка песок ниже 1 / 3 от буксировки субстраты культуры с обеих сторон с использованием тонких 1200-наждачной бумагой (McMaster Carr). Шлифование буксировки субстратов способствует росту аксонов от буксировки субстратов на покровное стационарных подложки. Вырезать 5 х 7 см кусок Aclar или использовать № 1 покровное стекло в качестве стационарных подложки (# 4865-1, Brain Research Labs, Ньютон, штат Массачусетс). Чистая йэлектронная культура подложках с разбавленным раствором Алконокс и тщательно промыть очищенную дН 2 O. Стерилизовать культуры субстратов путем погружения в 70% этаноле в течение 30 минут. Разрешить субстратов высохнуть на воздухе в течение стерильной капот культуры ткани. Чистая биореактор камеры разбавленной Алконокс и стерилизовать в автоклаве автоклаве контейнер. Сразу же после автоклавирования, трансфер в стерильных капот и дайте высохнуть на воздухе. Продолжая в стерильных капот, клей культуры субстратов в биореактор использованием кремния РТВ (Dow Corning # 732, McMaster Carr) и стерильные хлопковые тампоны (McMaster Carr): При буксировке ноги блока в полном вертикальном положении, клей культуры буксировки субстратов для буксировки ног блока при не-отшлифовать части. Избегать контакта с отшлифованной поверхностью культуры. Клей стационарных субстрат культуры на дно биореактор камеры. Удалите излишки клея и воздушные карманы, слегка удручает сухим ватным против склеенных поверхностей. Так как силиконовые RTV вымывается уксусной кислоты, которая является токсичным для нейронов, биореактор оставляют сохнуть под ультрафиолетовым светом в течение капотом на 2 полных дня до введения нейронных культур. Нижняя буксировки ноги блока для достижения 2-3мм перекрытия между кончиками отшлифовать буксировки субстратов и стационарных подложки. Crucial внимание должно быть обращено на размер перекрываются, если оно слишком большое, кончики субстратов буксировки может отвлечь от стационарных субстрата, снижение числа аксонов, которые охватывают перекрытия (рис. 3). Позиция буксировки блок в исходное положение, при буксировке стержней убираться внутрь биореактора. Затяните винты иммобилизации, чтобы предотвратить движение буксировки стержней до растянуть роста. 3. Нейронных культур Бассейн 1 мл 10 мкг / мл высоким молекулярным весом поли-D-лизина (кошка # 354210, BD, Бедфорд, штат Массачусетс) в сыворотке крови, свободных средств массовой информации в области подложка каждой полосе. Разрешить решение придерживаться в покое на 1 час при комнатной температуре. Ополоснуть 3x с дН 2 O, а затем окончательное промыть питательных сред. Пипетирование должны быть выполнены в задней части полосы движения, дальний подложка. Изолировать Спинной корневой Ganglia эксплантов (ДРГ) от E16 крысят. Использование стереомикроскопа, развести эксплантов в капли использованием чашки Петри. Сбор 3-4 эксплантов использовании 100 мкл пипетки и пластиной на краю отшлифовать буксировки субстрат культуры. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы пластины эксплантов на краю буксировки основание с помощью небольшой луже СМИ. До 1 мл культуральной среды на одну полосу движения достаточно, чтобы предотвратить испарение в течение нескольких часов при ограничении движения эксплантов. СМИ формулировка: Neurobasal с B-27 + 0,5 мм L-глютамин (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 г / л D-глюкозы (G-7528, Sigma, St . Луис, Миссури), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) и 20 мкМ FDU + 20 мкМ уридина митотических ингибиторов (F-0503, U-3003, Sigma). Прикрепите крышку и передачи биореактор для инкубатора в течение 1 часа или пока клетки придерживаться. Заполните биореактор с питательной среды в точке дальний эксплантов, чтобы избежать смещение. Инкубируйте биореактор для минимум 5 дней в то время как нейроны расширить аксонального процессов на стационарных подложки. 4. Axon Stretch роста Биореактор подвергается окончательной процедуры подготовки внутри стерильного капотом: Заполните резервуары в биореакторе с фосфатным буферным раствором, чтобы увлажнить камеры и ограничить испарение питательных сред. В нашей системе, выдолбленные стен корпуса служат резервуарами. Кроме того, небольшой чашке Петри крышки могут быть размещены по обе стороны от буксировки блок на вершине культуры переулков. Замените культуру средств массовой информации и заполнения полосы до отказа. Пипетирование должны быть выполнены в задней части полосы движения, дальний подложка. Сиденье биореактор в автоматизированных линейной таблицы движения. Если эксперимент будет выполняться в инкубатор, она не должна быть увлажненной из-за потенциальной коррозии автоматизированных линейной таблицы движения. Закрепите адаптер буксировки стержня в случае буксировки стержней. Использование Si программист пробежку этап линейной таблицы движения для согласования с адаптером стержень буксировки и закрепите ее на сцену. Для удобства подготовки последовательности Si программист заранее для того, чтобы манипулировать этап в конкретные приращения. Ослабьте винты на иммобилизацию биореактор камеру, чтобы свободное перемещение блока буксировки. Стретч применяется в поэтапно, начав серию маленьких шагов перемещения расположенных по времени выдержки (Пфистер, Ивата и соавт. 2006). Наша парадигма начинает принимать 2 шага мкм каждый 172 секунд,в результате чего чистая растянуть 1 мм в течение 24 часов. После одного дня, растянуть ставка может быть увеличили за счет увеличения или уменьшения перемещений время выдержки (таблица 2). Как только начинается ПГС, средства массовой информации изменения, как правило, не требуется. Со временем, однако, культура СМИ в целом оказывается кислым и видно по желтовато изменения цвета. Если дальнейшие эксперименты не требуется, старые СМИ никогда не бывает полностью истощены, но вместо этого лишь частично изменен для того, чтобы свести к минимуму травмы плавающей аксонов. 5. Представитель Результаты: Аксонального процессы могут проходить удивительно быстрый и надежный растянуть роста. Первоначально процесс начинается с периодом медленного растяжения (≤ 1mm/day), который состоит из небольших, редко перемещений. В течение первых 24 часов после растяжения, механотрансдукции нейронных путей рост происходит, в результате чего нейроны начинают дополнение к аксону цилиндра. В течение 24 часов непрерывной ПГС, аксоны показывают повышение толерантности к более и более частыми перемещениями. В общем, аксоны могут выдержать увеличение растянуть скорость 1mm/day каждые 12-24 часов (Пфистер, Ивата и др., 2004;. Пфистер, Bonislawski и др. 2006;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Увеличение растянуть ставку на слишком скоро, однако, может привести к более быстрому росту аксонов выбрать, но и привести к патологическим окклюзии, которая вызывает отключение. Стретч растущие аксоны имеют тенденцию к образованию пучки, напоминающие архитектуру пучки. Используя текущие протоколы, центральных, стрейч выросла часть аксонов пучки не имеют спайки с культурой субстрата. Только сначала придерживался, проксимальных и дистальных сегментов натяжных растущих аксонов остаются прикрепленными к культуре субстратов. Соответственно, центральная часть растянуть выросли аксонов в свободное плавание, и чувствительны к нарушению из-за обращения. По разным причинам некоторые аксоны не могут расти на протяжении применяются ставки. Например, нейрон DRG с двумя аксонального процессов, оба из которых проходят стрейч, возможно, не в состоянии перевести достаточное белка и расти на протяжении применяются ставки. Аксоны, который не может применяться будет растянуть тонкую следующий эффект Пуассона. Последующие растянуть приведет к закупорке аксонов, подавляя сборки, что приводит к патологическим отключения. Большинство аксонов, однако, способны пройти ПГС успешно, и только небольшой процент аксоны проходят это упрощение, как процесс. Рисунок 1. Axon Stretch Рост биореактора системы. () Биореактор камере культуры и автоматизированных линейной таблицы движения, (B) Шаг привода контроллера и Si Программирование программного обеспечения. Рисунок 2. Биореактор культуры палаты. Этот мультфильм показывает биореактор камеры сверху с снятой крышкой. Положение блока буксировки отражает конце стадии роста растянуть аксона. Стретч выросли аксонов можно увидеть в расслоения в культуре переулков. Рисунок 3. Культуры Субстрат Покрытие интерфейс. Этот мультфильм показывает компоненты буксировки механизма в каждой полосой из биореактора вид сбоку. (Топ) Правильный перекрытия буксировки и стационарных субстраты культуры. (Внизу) Чрезмерное перекрытия буксировки и стационарных субстратов причины кончик буксировки подложки виться. Фильм 1. Приложение культуры Подложки для биореактора палаты. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео Фильм 2. Покрытие из DRG эксплантов на Буксировка субстратов. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео Фильм 3. SiProgrammer использования. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео Фильм 4. Конус роста расширение на стационарные основания. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео Фильм 5. Axon Stretch роста. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео День Шаг 1 Стерилизация и сушки 2 Склеивание и Ассамблеи 4 Покрытия и нейронов Покрытие культуры 9 Начало Stretch роста Таблица 1. Эксперимент по расписанию. Время [ч] Стретч Оценить [мм / день] Время задержки [с] Общая длина [мм] Всего Time Stretch [дней] Претенциозность 24 1 172,8 0 1 Растягивать 24 1 172,8 1 2 Растягивать 24 2 86,4 3 3 Растягивать 24 3 57,6 6 4 Растягивать 24 4 43,2 10 5 Растягивать 24 5 34,6 15 6 Таблица 2. Stretch Оценить расписание. Все стрейч шаги 2 мкм в смещении (10 шагов шагового двигателя = 2 мкм стрейч).