אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

1. סקירה כללית של מערכת צמיחה למתוח אקסון bioreactor שתי גישות השולט כבר נוצלו ליישם כוחות ניסיוני נוירונים. לפי הגישה הראשונה, כוחות מוחלים על כל נוירון (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, ליו et al 2010). לפי הגישה השנייה, כוחות מוחלים ישירות האקסון על ידי משיכת חרוט הצמיחה. שימוש במחטים זכוכית, גישה זו האחרונה שימש ליצירת מודל חדש של האקסון (ברנל, Pullarkat et al 2007;. אוטול, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, היידמן, et al 2010), כדי לזהות ספי כוח עבור התארכות לבין הפתיחה (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. נג, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, נג et al 1992), ולנתח באשכולות הנוירוטרנסמיטר במסופי האקסון (Siechen, יאנג et al 2009).. רקמה ייחודית הנדסה הרחבה של שיטה זו פותחה כדי לייצר עצב גדול בונה באמצעות אקסון אוטומטיות למתוח צמיחה (ASG) מערכת bioreactor (איווטה, בראון et al 2006;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). לאחרונה, פיתחנו גרסה מוקטנת של מערכת bioreactor ללמוד ASG מיקרוסקופית בזמן אמת (Loverde, Ozoka et al. 2011). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול 9 ימים (לוח 1) אנו משתמשים כיום כדי להכין ולבצע bioreactors ASG שגרתי. בסך הכל מבצע: המערכת bioreactor ASG מורכב משלושה מרכיבים עיקריים, 1) תא bioreactor עם מסלולים עצמאיים (בארות מוארכים) שבו הנוירונים תרבותי התמתחה, 2) שולחן אוטומטיות תנועה ליניארית ליישם כוחות מתיחה 3) מנוע צעד בקר הכונן עם תוכנת שליטה צמיחה למתוח (איור 1). בקצרה, ייצור של אבי טיפוס bioreactor בוצעה בחנות מכונת באמצעות מכונת טחינה אנכיים (Bridgeport, אלמירה, ניו יורק). עבור biocompatibility, קלות עיקור ועמידות, הרכיבים הפנימיים bioreactor היו במכונה מ polyetheretherketone "08/03 (הצצה). פוליקרבונט שקוף שימש העפעפיים על מנת לאפשר צפייה במיקרוסקופ אור של תרבויות. קורוזיה עמידים 316 ברגים נירוסטה חומרה המלא ההרכבה (מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL). החדר bioreactor מורכבת מסגרת מתיחה המהווה 3 נתיבים, לחסום גרירה מתכווננת אשר מתפעל תאים לרוחב הנתיבים, ומוטות גרירה בולטות למניפולציות חיצוניות (איור 2). תרבויות נוירונים הם מצופה על Aclar מצעים הפנויה גרירה תרבות נתמך על ידי לחסום את גרירה (דמויות 2 ו -3). המצע coverslip הפנויה נייח מתחבר אל החלק התחתון של המסגרת מתיחות משתרע על פני כל 3 נתיבים. לפני מתיחה, הנוירונים מצופה חייב להרחיב תהליכים axonal מן המצע גרירה על גבי מצע נייח באמצעות הרחבה חרוט צמיחה. אוכלוסיית האקסונים כי הגשר מצעים יהיה לאחר מכן עוברים מתיחה ידי עקירה השליטה לחסום את הגרירה. הטבלה אוטומטיות תנועה ליניארית מורכב מנוע צעד (HT23-397, מוצרים Motion יישומית, Watsonville, CA) ואת שולחן תנועה ליניארית (MIPS-2-10-1.0mm, מערכות סרוו, Monteville, NJ) רכוב על שולחן יישור delrin . החדר bioreactor יושב בתוך הטבלה במקביל השולחן תנועה ליניארית. מוטות גרירה המשתרעת החדר bioreactor מהודקים אל השולחן בתנועה ליניארית באמצעות מתאם. צעד הכונן המנוע בקר (Si 2035, מוצרים Motion יישומית) מתוכנת באמצעות תוכנה כלולה סי מתכנת לשלוט מניפולציה של מצעים גרירה. למתוח axonal מוחל באופן הדרגתי על ידי לקיחת שורה של צעדים תזוזה קטנה במרווחים על ידי לשכון פעמים (פפיסטר, איווטה et al 2004;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). מערכת מבוקרת מחשב מספק את היכולת התוכנית פרופילים מותאמים אישית עבור ASG, והוא חיוני ניסויים רציפה על פני כמה ימים עד שבועות. 2. הכנת bioreactor הקאמרית הכנת מצעים הפנויה תרבות גרירה נייח לתרבות העצבית: מצעים גרירה בתרבות נחתכים מ 8.5 "x 11" גיליונות של הסרט Aclar (33 ג 2.0 מיליון, בדיקה מבנה, West Chester, PA). בעזרת סכין חד לחתוך את מצעים כ 0.5 x 2.5cm, או מעט קצר יותר מאשר רוחב של נתיבים כדי לאפשר לפחות 1-2mm אישור משני הצדדים. קלות חול התחתון 1 / 3 rd של מצעים תרבות גרירה משני הצדדים באמצעות נייר זכוכית עדין 1200, חצץ (מקמאסטר קאר). מלטש של מצעים גרירה מאפשרת צמיחה של אקסונים מן מצעים גרירה על גבי המצע coverslip נייח. גזור 5 x 7 ס"מ פיסת Aclar או להשתמש מס '1 coverslip זכוכית לשמש מצע נייח (# 4865-1, המוח מעבדות מחקר, ניוטון, MA). נקו המצעים דואר התרבות פתרון Alconox לדלל ולשטוף היטב עם מטוהרים DH 2 O. לעקר את תרבות מצעים ידי טבילה באתנול 70% במשך 30 דקות. אפשר מצעים לייבוש באוויר בתוך ברדס רקמה סטרילית תרבות. נקו את תא bioreactor עם Alconox לדלל ו החיטוי לעקר בתוך מיכל החיטוי. מיד לאחר מעוקר, להעביר ברדס סטרילית ולאפשר לאוויר יבש. המשך בתוך דבק סטרילי מכסה המנוע, מצעים תרבות bioreactor באמצעות סיליקון RTV (Dow Corning # 732, מקמאסטר קאר), כותנה סטרילי היטה מטליות (מקמאסטר קאר): עם הרגליים לחסום גרירה במצב זקוף המלא שלהם, הדבק מצעים תרבות גרירה לרגליים לחסום גרירה על החלק הלא שייף. הימנעו ממגע עם המשטח תרבות שייף. דבק המצע תרבות נייח אל החלק התחתון של החדר bioreactor. הסרת דבק עודף כיסי אוויר ידי בעדינות מדכא משטח יבש נגד מצעים מודבק. מאז חומצה אצטית RTV סיליקון מדיחים כי הוא רעיל נוירונים, bioreactor הוא נותר יבש תחת אור UV בתוך מכסה המנוע של 2 ימים מלאים לפני מציגה תרבויות עצביים. מנמיכים את הרגליים לחסום גרירה להשיג 2-3mm חפיפה בין קצות sanded גרירה מצעים ואת המצע נייח. תשומת לב חיוני חייב להיות משולם לגודל של חפיפה, אם הוא גדול מדי, את הטיפים של מצעים גרירה עלול להסיט את המצע נייחים; צמצום מספר אקסונים כי ההיקף החפיפה (איור 3). מקם את הבלוק גרירה בעמדת הזינוק, עם מוטות גרירה חזר בו בתוך bioreactor. הדקו את הברגים immobilization כדי למנוע תנועה של מוטות גרירה לפני למתוח את הצמיחה. 3. עצבי תרבויות בריכת 1mL של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​משקל מולקולרי גבוה poly-d-ליזין (חתול # 354210, BD, בדפורד, מסצ'וסטס) בסרום ללא התקשורת באזור המצע ממשק של כל מסלול. אפשר פתרון לדבוק באין מפריע במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. יש לשטוף בעדינות 3x עם DH 2 O, ואחריו סופי לשטוף עם התקשורת והתרבות. Pipetting צריכה להתבצע בחלק האחורי של הנתיבים, הרחוקה ממשק המצע. בודד הגבי בגרעיני הבסיס explants (DRGs) מן החולדה E16 הגור. שימוש stereomicroscope, לדלל את explants לתוך טיפות באמצעות בצלחות פטרי. איסוף explants 3-4 בעזרת פיפטה 100 צלחת μL ואל קצה המצע שייף את התרבות גרירה. יש להקפיד על הצלחת explants בקצה המצע גרירה באמצעות שלולית קטנה של התקשורת. עד 1mL של התקשורת בתרבות לכל נתיב מספיקה כדי למנוע אידוי במשך כמה שעות תוך הגבלת התנועה של explants. ניסוח מדיה: Neurobasal עם B-27 + 0.5mm-L-גלוטמין (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2.5G / L D-גלוקוז (G-7528, Sigma, רח' . לואיס, מיזורי), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) ו – 20 מיקרומטר FdU + 20 מיקרומטר mitotic uridine מעכבי (F-0503, U-3003, סיגמא). צרף את המכסה כדי להעביר את bioreactor באינקובטור במשך שעה או עד 1 תאים לדבוק. מלאו את bioreactor עם התקשורת בתרבות בנקודה הרחוקה ביותר explants כדי למנוע dislodgment. דגירה bioreactor מינימום של 5 ימים ואילו נוירונים להאריך תהליכים axonal על מצע נייח. 4. אקסון צמיחה למתוח Bioreactor עובר תהליכי הכנה סופית בתוך ברדס סטרילי: מילוי מאגרי בתוך bioreactor עם פוספט שנאגרו מלוחים כדי ללחלח את החדר והתאיידות להגביל את אמצעי התקשורת והתרבות. במערכת שלנו, את קירות המתחם חלולים לשמש המאגרים. לחלופין, קטן מכסים בצלחת פטרי יוטלו על צדי הרחוב גרירה על גבי נתיבים תרבות. החלף את המדיה תרבות למלא את הנתיבים עד אפס מקום. Pipetting צריכה להתבצע בחלק האחורי של הנתיבים, הרחוקה ממשק המצע. במושב bioreactor בתוך הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי. אם הניסוי יש להפעיל בתוך אינקובטור, זה לא חייב להיות humidified עקב קורוזיה הפוטנציאל של שולחן תנועה אוטומטית הליניארי. הדקו את מתאם מוט הגרירה על מוטות גרירה. באמצעות תוכנה סי מתכנת לרוץ שלב בטבלה תנועה ליניארית ליישר עם מתאם מוט הגרירה להדק אותה אל הבמה. לנוחיותך, להכין רצפים סי מתכנת מראש על מנת לתפעל את הבמה במרווחים ספציפיים. שחררו את הברגים immobilization על החדר bioreactor כדי לאפשר תנועה חופשית של גוש גרירה. מתיחה מוחל באופן הדרגתי על ידי ייזום סדרה של צעדים קטנים במרווחים על ידי עקירה לשכון פעמים (פפיסטר, איווטה et al. 2006). הפרדיגמה שלנו מתחיל ידי לקיחת 2 צעדים מיקרומטר כל 172 שניות,וכתוצאה מכך למתוח 1mm נטו מעל 24 שעות. אחרי יום אחד, שיעור למתוח ניתן ramped ידי הגדלת עקירה או להקטין את זמן להתעכב (לוח 2). לאחר ASG הוא יזם, שינויים בתקשורת הם בדרך כלל לא נדרש. במשך הזמן, עם זאת, תרבות התקשורת בדרך כלל הופך חומצי ניכרת על ידי שינוי בצבע צהבהב. ניסויים נוספים אם נדרש, המדיה הישנה לא ריקה לחלוטין, אך במקום לשנות באופן חלקי בלבד על מנת למזער את הטראומה אקסונים צף. 5. נציג תוצאות: תהליכים axonal יכול לעבור לצמיחה מתיחה מהירה מאוד חזקים. בתחילה, התהליך מתחיל בתקופה של מתיחות איטי (≤ 1mm/day) שמורכבת, התקות קטנות נדירים. בתוך 24 השעות הראשונות של מתיחות, mechanotransduction של מסלולים עצביים מתרחשת צמיחה, לפיה הנוירונים מתחילים בנוסף הגליל האקסון. תוך 24 שעות חברת ASG רציפה, אקסונים להראות סובלנות גוברת התקות יותר תכופים יותר. באופן כללי, אקסונים יכול לעמוד עלייה בשיעור של למתוח 1mm/day כל 12-24 שעות (פפיסטר, איווטה et al 2004;. פפיסטר, Bonislawski et al 2006;.. פפיסטר, איווטה et al 2006). הגדלת שיעור למתוח מוקדם מדי, לעומת זאת, עלול להוביל לצמיחה מהירה יותר של אקסונים לבחור אבל תביא גם חסימה פתולוגית הגורמת לניתוק. מתיחה וגדלה אקסונים יש נטייה ליצור חבילות, שמזכיר את הארכיטקטורה של fascicles. ניצול פרוטוקולים הנוכחי, החלק המרכזי, גדל מתיחה של חבילות האקסון אין הידבקויות למצע תרבות. רק דבק בתחילה, קטעי הפרוקסימלית ומ דיסטלי של למתוח וגדלה אקסונים להישאר צמודים מצעים תרבות. לפיכך, החלק המרכזי של אקסונים גדל למתוח צפים בחופשיות, רגישים הפרעה עקב הטיפול. עבור מגוון רחב של סיבות, אקסונים מסוימים לא יכול לצמוח בשיעור למתוח מיושם. לדוגמה, תא עצב DRG עם שני תהליכים axonal, אשר שניהם עוברים מתיחה, לא יוכל לתרגם את החלבון מספיקות לצמוח בקצב להחיל את המתיחה. אקסונים שלא יכול להכיל את המתיחה להחיל יהיה דק הבאים אפקט של פואסון. מתיחה לאחר יוביל חסימה של אקסונים, הרכבה עיכוב, המוביל ניתוק פתולוגי. רוב האקסונים, לעומת זאת, מסוגלים לעבור ASG בהצלחה רק אחוז קטן של האקסונים עוברים את התהליך הזה כמו גיזום. באיור 1. הצמיחה אקסון למתוח מערכת bioreactor. (א) bioreactor קאמרית תרבות & תנועה אוטומטי שולחן ליניארי, (ב) שלב מנוע כונן בקר ותוכנה סי תכנות. 2. איור לשכת bioreactor תרבות. הקריקטורה מתארת ​​את החדר bioreactor מלמעלה עם מכסה הסיר. העמדה של גוש גרירה משקף את סוף שלב הצמיחה למתוח את האקסון. אקסונים גדל מתיחה ניתן לראות צרורות בתוך נתיבי תרבות. איור 3. התשתית תרבות ממשק ציפוי. הקריקטורה מתארת ​​את הרכיבים של מנגנון גרירה בתוך נתיב אחד bioreactor מתצוגת הצד. (למעלה) חפיפה נכונה של מצעים תרבות גרירה נייח. (התחתון) חפיפה מוגזמת של מצעים גרירה נייח גורם קצה המצע גרירה להתכרבל. סרט 1. קובץ מצורף של מצעים התרבות bioreactor הקאמרית. לחץ כאן כדי לצפות וידאו סרט 2. ציפוי של DRG Explants על גבי מצעים גרירה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו סרט 3. שימוש SiProgrammer. לחץ כאן כדי לצפות וידאו סרט 4. קון צמיחה הרחבה על מצע נייחים. לחץ כאן כדי לצפות וידאו סרט 5. הצמיחה אקסון מתיחה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו יום צעד 1 עיקור & ייבוש 2 הדבקה & האסיפה 4 ציפויים ו-PCB תרבות העצבית 9 צמיחה למתוח התחלה 1. טבלת ניסוי לו"ז. זמן [שעות] דרג למתוח [mm / יום] להתעכב זמן [s] סה"כ אורך [מ"מ] זמן למתוח סה"כ [ימים] היומרה 24 1 172.8 0 1 למתוח 24 1 172.8 1 2 למתוח 24 2 86.4 3 3 למתוח 24 3 57.6 6 4 למתוח 24 4 43.2 10 5 למתוח 24 5 34.6 15 6 2. טבלה מתיחה שיעור התוספת. כל הצעדים מתיחה הם 2 מיקרומטר עקירה (10 מנוע צעדים צעד = 2 למתוח מיקרומטר).