Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

1. Übersicht über die Axon Stretch Growth Bioreaktor-System Zwei vorherrschende Ansätze wurden verwendet, um experimentelle Kräfte zu Neuronen gelten. Im ersten Ansatz werden die Kräfte auf die gesamte Neuron (.; Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010 Lu, Franze et al 2006) angewendet. Im zweiten Ansatz werden die Kräfte direkt auf das Axon, indem Sie auf das Wachstum Kegel aufgetragen. Mit Glasnadeln hat dieser zweite Ansatz zur Modellierung Bildung neuer Axon (.; O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Bernal, Pullarkat et al 2007 Lamoureux, Heidemann et al 2010) verwendet wurde, zu zwingen, Schwellenwerte für die Dehnung zu identifizieren und Abfahren (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), auf und Neurotransmitter-Clustering in Axonterminalen analysieren (Siechen, Yang et al 2009).. Eine einzigartige Tissue Engineering Erweiterung dieser Methode wurde entwickelt, um große Nervenzellen produzieren Konstrukte mit Hilfe eines automatisierten Axon Stretch Growth (ASG) Bioreaktor-System (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Vor kurzem haben wir eine miniaturisierte Version der Bioreaktor-System zu studieren ASG mikroskopisch in Echtzeit (Loverde, Ozoka et al. 2011). Hier beschreiben wir die 9-Tage-Protokoll (Tabelle 1) die wir derzeit zur Bioreaktoren vorzubereiten und durchzuführen ASG routinemäßig. Insgesamt Operation: Die ASG-Bioreaktor-System besteht aus drei Hauptkomponenten, 1) einen Bioreaktor Kammer mit unabhängigen Bahnen (längliche Vertiefungen), wo Neuronen kultiviert und gedehnt werden, 2) eine automatisierte lineare Bewegung Tabelle Dehnungskräfte und 3) einen Schrittmotor gelten zusammen Antriebsregler mit Software zu strecken Wachstum (Abbildung 1) zu kontrollieren. Kurz gesagt, wurde die Herstellung von Prototypen Bioreaktor in einer Maschinenhalle mit einem Vertikal-Fräsmaschine (Bridgeport, Elmira, NY) durchgeführt. Für Biokompatibilität, einfache Sterilisation und Haltbarkeit wurden die internen Bioreaktor Komponenten von 3 / 8 "Polyetheretherketon (PEEK) gefertigt. Transparentes Polycarbonat wurde für Deckel verwendet werden, um für die Lichtmikroskopie und Anzeigen von Kulturen zu ermöglichen. Korrosionsbeständige Edelstahl 316 Schrauben und Hardware komplett die Montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). Der Bioreaktor Kammer besteht aus einem Spannrahmen, dass 3 Fahrspuren, eine einstellbare Schlepp-Block, der Zellen in den Gassen manipuliert und hervorstehende Abschleppen Stangen Formulare für externe Manipulation (Abbildung 2) besteht. Neuronale Kulturen werden auf Einweg-Aclar Abschleppen Kultur Substrate durch das Abschleppen Block (Abb. 2 & 3) unterstützt überzogen. Ein Einweg-Deckglas stationären Substrat wird an der Unterseite des Spannrahmens und erstreckt sich über alle 3 Fahrspuren. Vor Stretching, müssen verzinkt Neuronen axonalen Prozessen aus dem Abschleppen Substrat hinaus auf die stationären Substrat über Wachstum Kegel-Erweiterung. Die Bevölkerung der Axone, die Brücke der Substrate werden anschließend unterziehen Strecke durch die Kontrolle Verschiebung der Schlepp-Block. Die automatisierte lineare Bewegung Tisch besteht aus einem Schrittmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) und eine lineare Bewegung Tabelle (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Systems, Monteville, NJ), montiert auf eine delrin Ausrichtung Tisch . Der Bioreaktor Kammer ist in der Tabelle parallel zur linearen Bewegung Tisch. Das Abschleppen Stangen, die sich von den Bioreaktor Kammer sind die lineare Bewegung Tabelle mit Hilfe eines Adapters befestigt. Der Schrittmotor-Controller (Si 2035, Applied Motion Products) ist so programmiert, mit dem mitgelieferten Si Programmierer Software zur Manipulation des ziehenden Substrate zu steuern. Axonal Strecke ist in einem schrittweise, indem sie eine Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (..; Pfister, Iwata et al 2006 Pfister, Iwata et al 2004) Abstand aufgebracht. Das computergesteuerte System bietet die Möglichkeit, individuelle Profile für ASG-Programm, und ist von wesentlicher Bedeutung für die kontinuierliche Experimentieren über mehrere Tage bis Wochen. 2. Vorbereitung des Bioreaktors Kammer Bereiten Sie die Einweg-Abschlepp-und stationären Kultur Substrate für neuronale Kultur: Abschleppen Kultur Substrate von 8,5 cut "x 11" Blatt Aclar Film (33C 2,0 Mio., Struktur Probe, West Chester, PA). Mit einem scharfen Messer schneiden Sie die Substrate auf ca. 0,5 x 2,5 cm, oder etwas kürzer als die Breite der Fahrspuren auf mindestens 1-2mm Abstand auf beiden Seiten zu ermöglichen. Schleifen Sie die unteren 1 / 3 rd des Zugfahrzeugs Kultursubstraten auf beiden Seiten mit feinen 1200-Schleifpapier (McMaster Carr). Schleifen des ziehenden Substrate ermöglicht Wachstum von Axonen aus dem Abschleppen Substrate auf das Deckglas stationären Substrat. Schneiden Sie ein 5 x 7cm Stück Aclar oder verwenden Sie einen Nr. 1 Deckglas als die stationäre Substrat dienen (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). Saubere the Kultur Substrate mit einer verdünnten Lösung Alconox und gründlich mit gereinigtem dH 2 O. Sterilisieren der Kultur Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 Minuten. Lassen Sie die Substrate an der Luft innerhalb einer sterilen Gewebekultur Haube trocknen. Reinigen Sie den Bioreaktor Kammer mit verdünnter Alconox und Autoklaven in einem Autoklaven Behälter zu sterilisieren. Unmittelbar nach dem Autoklavieren, um eine sterile Haube übertragen und an der Luft trocknen. Weiterbildung innerhalb der sterile Haube, kleben Sie die Kultur Substrate in den Bioreaktor mit Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) und sterile Wattestäbchen Abstriche (McMaster Carr): Mit dem Abschleppen Block Beine in voller aufrechter Position, Leim das Schleppen Kultur Substrate, die Schlepp-Block Beine an den Nicht-geschliffen Teil. Vermeiden Sie den Kontakt mit der geschliffenen Oberfläche Kultur. Kleben Sie die stationäre Kultur Substrat auf den Boden des Bioreaktors Kammer. Entfernen Sie überschüssigen Kleber und Lufteinschlüsse durch leichtes Drücken einer trockenen Tupfer gegen die verklebten Substrate. Da Silikon RTV Laugen Essigsäure, die giftig für Neuronen ist, wird der Bioreaktor links unter UV-Licht innerhalb der Haube trocknen 2 volle Tage vor der Einführung von neuronalen Kulturen. Senken Sie die Schlepp-Block Beine zu einem 2-3mm Überlappung zwischen den Spitzen der geschliffen Abschleppen Substraten und dem stationären Substrat zu erreichen. Entscheidend Augenmerk muss auf die Größe der Überlappung bezahlt werden, wenn sie zu groß ist, die Spitzen der Schlepp-Substraten kann abzulenken off der stationären Substrat; Reduzierung der Anzahl der Axone, die die Überlappung (Abbildung 3) umfassen. Positionieren Sie den Schlepp-Block an der Ausgangsposition, mit dem Abschleppen Stäbe eingefahren Inneren des Bioreaktors. Ziehen Sie die Immobilisierung Schrauben zur Bewegung des Zugfahrzeugs Stangen vor zu verhindern, um Wachstum zu strecken. 3. Neuronalen Kulturen Pool 1 ml von 10 pg / mL hochmolekularen Poly-D-Lysin (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-freien Medien an der Substrat-Grenzfläche von jeder Spur. Lassen Sie die Lösung haften für 1 Stunde bei Raumtemperatur ungestört. Spülen Sie vorsichtig 3x mit dH 2 O, durch eine abschließende Spülung mit Kulturmedien gefolgt. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. Isolieren Spinalganglien Explantate (DRGs) aus einem E16 Jungtier. Mit einem Stereomikroskop, verdünnte die Explantate in Tropfen mit Petrischalen. Sammeln Sie 3-4 Explantate mit einem 100 ul Pipette und Teller auf den Rand des geschliffenen Abschleppen Kultur Substrat. Es muss auf den Teller der Explantate am Rande des Zugfahrzeugs Substrat mit einer kleinen Pfütze Medien aufgegriffen werden. Bis zu 1 ml der Kultur Medien pro Spur genügt, um die Verdampfung für mehrere Stunden zu verhindern, während Begrenzung der Bewegung der Explantate. Medien Formulierung: Neurobasal mit B-27 + 0,5 mM L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HALLO (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) und 20 uM FdU + 20 uM Uridin Mitosehemmer (F-0503, U-3003, Sigma). Bringen Sie den Deckel und den Transfer der Bioreaktor in einen Inkubator für 1 Stunde oder bis die Zellen anhaften. Füllen Sie den Bioreaktor mit Kulturmedien an dem Punkt am weitesten die Explantate auf dislodgment zu vermeiden. Inkubieren der Bioreaktor für mindestens 5 Tage, während Neuronen axonalen Fortsätze auf den stationären Substrat. 4. Axon Stretch Growth Der Bioreaktor erfährt letzten Vorbereitungen Verfahren in einem sterilen Haube: Füllen Stauseen im Bioreaktor mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in die Kammer und begrenzen Verdampfung von Kulturmedien zu befeuchten. In unserem System dienen die ausgehöhlten Gehäusewände als Reservoir. Alternativ können kleine Petrischale Deckeln auf beiden Seiten des ziehenden Block oben auf der Kultur Bahnen platziert werden. Ersetzen Sie den Kulturmedien und füllen die Gassen, um die Kapazität. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. Sitz der Bioreaktor in der automatisierten lineare Bewegung Tisch. Wenn das Experiment ist es, innerhalb eines Inkubators ausgeführt werden, es darf nicht befeuchtet werden wegen möglicher Korrosion der automatisierten lineare Bewegung Tisch. Befestigen Sie die Schleppstange Adapter mit dem Abschleppen Stangen. Mit Si Programmer Software Jog der Bühne der linearen Bewegung Tabelle mit den Schleppstange Adapter ausrichten und befestigen Sie ihn auf die Bühne. Für die Bequemlichkeit, bereiten Si Programmer-Sequenzen im Voraus, um die Bühne in bestimmten Schritten zu manipulieren. Lösen Sie die Schrauben auf der Immobilisierung Bioreaktor Kammer auf Freizügigkeit des ziehenden Block zu ermöglichen. Stretch ist in schrittweise durch die Initiierung einer Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (Pfister, Iwata et al. 2006) Abstand aufgebracht. Unser Paradigma beginnt, indem sie 2 pm Schritte jede 172 Sekunden,was zu einem Netto-1mm erstrecken sich über 24 Stunden. Nach einem Tag können die Strecke Rate werden durch die Erhöhung der Verschiebung oder Verringerung der Verweildauer (Tabelle 2) hochgefahren. Sobald ASG eingeleitet wird, sind Medien Veränderungen in der Regel nicht erforderlich. Im Laufe der Zeit jedoch Kulturmedien in der Regel wird sauer und ist offensichtlich durch eine gelbliche Verfärbung. Wenn weitere Experimente erforderlich ist, alte Medien nie vollständig entleert, sondern nur teilweise geändert werden, um Traumata zu schweben Axone zu minimieren. 5. Repräsentative Ergebnisse: Axonal Prozesse durchlaufen bemerkenswert schnelle und robuste Strecke Wachstum. Zunächst beginnt der Prozess mit einer Periode langsamen Strecken (≤ 1mm/day), die von kleinen, selten Verschiebungen besteht. Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Dehnung, Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums Wege erfolgt, wobei Neuronen beginnen neben dem Axon Zylinder. Innerhalb von 24 Stunden ununterbrochene ASG, zeigen Axone eine wachsende Toleranz gegenüber stärkere und häufigere Verschiebungen. Im Allgemeinen können Axone standhalten eine Zunahme der Strecke von 1mm/day alle 12-24 Stunden (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Die Erhöhung der Stretch-Rate zu früh, kann jedoch zu einem schnelleren Wachstum der Axone wählen führen, sondern auch zu pathologischen Okklusion, dass die Trennung Ursachen führen. Stretch-wachsenden Axone haben die Tendenz, Bündel bilden, ähnlich der Architektur der Faszikel. Mit Hilfe gängigen Protokolle, die zentrale, Stretch gewachsen Teil des Axon bündelt keine Verwachsungen, die Kultur Substrat. Nur die zunächst verklebt, proximalen und distalen Segmente der Strecke wachsenden Axone verbunden bleiben, um die Kultur Substraten. Dementsprechend treiben den zentralen Teil der Strecke gewachsen Axone frei und sind empfindlich gegen Störungen durch die Handhabung. Für eine Vielzahl von Gründen, können einige Axone nicht an der Strecke angewendet Rate wachsen. Zum Beispiel, ein DRG Neuron mit zwei axonalen Prozessen, die beide durchlaufen strecken, sind möglicherweise nicht in der Lage, ausreichend Protein übersetzen und zu wachsen bei den angewendeten Reckrate. Axone, die nicht unterbringen kann die angelegte Strecke wird nach Poisson-Effekt dünn. Nachfolgende Strecke wird zum Verschluss der Axone hemmen Montage führen, was zu pathologischen Trennung. Die Mehrzahl der Axone, sind jedoch in der Lage zu unterziehen ASG erfolgreich und nur ein kleiner Prozentsatz der Axone unterziehen diesem Schnitt-like-Prozess. Abbildung 1. Axon Stretch Growth Bioreaktor-System. (A) Bioreaktor Zellkulturkammer & Automated lineare Bewegung Tisch, (B) Schrittmotor-Controller und Si Programmiersoftware. Abbildung 2. Bioreaktor Kultur Kammer. Diese Karikatur zeigt den Bioreaktor Kammer von oben mit dem Deckel entfernt. Die Position des ziehenden Block spiegelt das Endstadium Axon Stretch-Wachstum. Stretch gewachsen Axone können in Bündeln innerhalb der Kultur Gassen zu sehen. Abbildung 3. Nährsubstrat Plating-Schnittstelle. Diese Karikatur zeigt die Komponenten des ziehenden Mechanismus innerhalb jeder Spur des Bioreaktors aus der Seitenansicht. (Top) Korrigieren Überlappung der Abschlepp-und stationären Kultur Substraten. (Bottom) Übermäßige Überlappung der Abschlepp-und stationären Substraten bewirkt, dass die Spitze des Zugfahrzeugs Substrat zu kräuseln. Movie 1. Befestigung der Kultur Substrate zu Bioreaktor Kammer. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen Movie 2. Plating der DRG Explantate auf Abschleppen Substrate. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen Movie 3. SiProgrammer Usage. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen Movie 4. Growth Cone-Erweiterung auf stationären Substrat. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen Movie 5. Axon Stretch Growth. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen Tag Schritt 1 Sterilisation und Trocknung 2 Kleben & Montage 4 Coatings & Neuronale Kultur Plating 9 Stretch Growth Anfang Tabelle 1. Experiment Schedule. Time [hr] Stretch Rate [mm / Tag] Verweilzeit [s] Gesamtlänge [mm] Insgesamt Stretch Zeit [Tage] Anspruch 24 1 172,8 0 1 Strecken 24 1 172,8 1 2 Strecken 24 2 86,4 3 3 Strecken 24 3 57,6 6 4 Strecken 24 4 43,2 10 5 Strecken 24 5 34,6 15 6 Tabelle 2. Stretch Rate Schedule. Alle strecken Schritte sind 2 um Verschiebung (10 Schrittmotor Schritte = 2 pm Dehnung).