Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

1. Overzicht van de Axon Stretch Growth Bioreactor System Twee overheersende benaderingen zijn gebruikt om experimentele krachten van toepassing zijn op neuronen. In de eerste benadering, zijn krachten toegepast op de gehele neuron (Lu, Franze et al., 2006;. Chetta, Kye et al. 2010;.. Lindqvist, Liu et al. 2010). In de tweede benadering, zijn krachten direct op het axon door te trekken op de groei kegel. Met behulp van glas naalden, heeft deze laatste benadering is gebruikt om het model de vorming van nieuwe axon (Bernal, Pullarkat et al. 2007;. O'Toole, Lamoureux et al. 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al. 2010), te dwingen drempels voor rek te identificeren en retractie (Dennerll, Lamoureux et al. 1989;. Zheng, Lamoureux et al. 1991;.. Lamoureux, Zheng et al. 1992), naar neurotransmitter clustering en te analyseren in axon terminals (Siechen, Yang et al. 2009.). Een unieke tissue engineering uitbreiding van deze methode is ontwikkeld om grote zenuw produceren construeert met behulp van een geautomatiseerd Axon Stretch Growth (ASG) bioreactor systeem (Iwata, Browne et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Onlangs ontwikkelden we een geminiaturiseerde versie van de bioreactor systeem om te studeren ASG microscopisch in real time (Loverde, Ozoka et al.. 2011). Hier hebben we detail de 9-daagse protocol (tabel 1) we momenteel gebruiken om bioreactoren voor te bereiden en ASG routinematig uit te voeren. Overall Werking: Het ASG bioreactor systeem bestaat uit drie hoofdcomponenten, 1) een bioreactor kamer met onafhankelijke rijstroken (langwerpige putten) waar neuronen worden gekweekt en uitgerekt, 2) een geautomatiseerde lineaire beweging tafel om stretching krachten en 3) een stappenmotor toe te passen aandrijving controller met software op te rekken groei (figuur 1) te controleren. In het kort werd de fabricage van bioreactor prototypes uitgevoerd in een werkplaats met behulp van een verticale freesmachine (Bridgeport, Elmira, NY). Voor biocompatibiliteit, het gemak van sterilisatie en duurzaamheid, zijn de interne bioreactor componenten vervaardigd uit 3 / 8 "polyetheretherketone (PEEK). Transparant polycarbonaat werd gebruikt voor deksels om voor licht microscopie en bekijken van culturen. Corrosiebestendig 316 roestvrij stalen schroeven en de hardware te voltooien de montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). De bioreactor kamer bestaat uit een frame dat zich uitstrekt drie rijstroken, een instelbare sleep-blok dat cellen over de rijstroken manipuleert, en uitstekende slepen staven vormen voor externe manipulatie (figuur 2). Neuronale culturen zijn uitgeplaat op wegwerp Aclar slepen cultuur substraten gesteund door het trekkende blok (figuren 2 & 3). Een wegwerp dekglaasje stationair ondergrond hecht aan de onderkant van het frame en stretching omvat alle drie rijstroken. Voorafgaand aan stretching, moet plated neuronen te breiden axonale processen van het trekkende substraat op de stationaire substraat via groeikegel extensie. De bevolking van axonen die brug de substraten vervolgens zal strekken ondergaan door het beheersen van verplaatsing van het trekkende blok. De geautomatiseerde lineaire beweging tabel bestaat uit een stappenmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) en de lineaire beweging tafel (MIPS-2-10-1,0 mm, Servo Systems, Monteville, NJ), gemonteerd op een delrin alignment tafel . De bioreactor kamer zit in de tabel parallel aan de lineaire beweging tafel. Het trekkende staven dat zich uitstrekt van de bioreactor kamer zijn bevestigd aan de lineaire beweging tafel met behulp van een adapter. De stap aandrijving controller (Si 2035, Applied Motion Products) is geprogrammeerd met behulp van de meegeleverde Si programmeur software om manipulatie van het trekkende substraten te controleren. Axonale stretch wordt toegepast op een stapsgewijze manier door het nemen van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al., 2004;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Dit computergestuurde systeem biedt de mogelijkheid om aangepaste profielen voor ASG, en is essentieel voor continue experimenten gedurende enkele dagen tot weken. 2. Voorbereiding van de Bioreactor Kamer Bereid de wegwerp sleep-en stationaire cultuur neuronale substraten voor cultuur: Slepen cultuur substraten worden gesneden van 8,5 "x 11" vellen Aclar film (33C 2,0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Met behulp van een scherp mes de substraten teruggebracht tot ongeveer 0,5 x 2,5 cm, of iets korter dan de breedte van de rijstroken ten minste 1-2mm speling laten aan beide kanten. Licht zand de onderste 1 / 3 van het trekkende cultuur substraten aan beide zijden met fijn schuurpapier korrel 1200 (McMaster Carr). Schuren van het trekkende substraten faciliteert groei van axonen van het trekkende substraten op het dekglaasje stationaire substraat. Snijd een 5 x 7cm stuk Aclar of gebruik een nummer 1 glas dekglaasje om te dienen als de stationaire substraat (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). Schoon ee cultuur substraten met een verdunde oplossing Alconox en grondig spoelen met gezuiverde dH 2 O. Steriliseer de cultuur substraten door middel van onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 minuten. Laat de substraten te droge lucht in een steriele cultuur kap. Reinig de bioreactor kamer met verdund Alconox en autoclaaf gesteriliseerd in een autoclaaf container. Direct na het autoclaveren, over te dragen aan een steriele kap en aan de lucht laten drogen. Te vervolgen binnen de steriele kap, lijm de cultuur substraten aan de bioreactor met behulp van Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) en steriele katoen getipte swabs (McMaster Carr): Met het trekkende blok benen in hun volle rechtop, lijm het trekkende cultuur substraten op de trekhaak te blokkeren benen bij de niet-geschuurde gedeelte. Vermijd contact met de geschuurde oppervlak cultuur. Lijm de stationaire cultuur substraat op de bodem van de bioreactor kamer. Verwijder overtollige lijm en luchtzakken door zachtjes indrukken van een droog wattenstaafje tegen de gelijmde substraten. Sinds Siliconen RTV loogt azijnzuur dat giftig is voor neuronen, is de bioreactor links naar onder UV-licht drogen binnen de kap voor twee volle dagen voorafgaand aan de introductie van neuronale culturen. Hoe lager de slepen blok benen een 2-3mm overlap tussen de uiteinden van de geschuurde slepen substraten en de stationaire substraat te bereiken. Cruciale aandacht moet worden besteed aan de grootte van de overlap, als het te groot is, de uiteinden van het trekkende substraten kan uit afleiden van de stationaire substraat, vermindering van het aantal axonen die de overlap (figuur 3) span. Plaats de sleep-blok aan de start positie, met het trekkende staven teruggetrokken in de bioreactor. Draai de immobilisatie schroeven om beweging van het trekkende staven voorafgaand voorkomen om de groei te rekken. 3. Neuronale Culturen Pool 1 ml van 10 ug / ml hoog moleculair gewicht poly-D-lysine (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-vrije media in de ondergrond raakvlak gebied van elke baan. Laat de oplossing ongestoord houden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel voorzichtig 3x met dH 2 O, gevolgd door een laatste spoelbeurt met cultuur media. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. Isoleer achterwortelganglia explantaten (DRG) van een E16 rat pup. Met behulp van een stereomicroscoop, verdun het explantaten in druppels met behulp van petrischalen. Verzamel 3-4 explantaten met behulp van een 100 ul pipet en de plaat op de rand van de geschuurde slepen cultuur substraat. Zorg moet worden genomen om het bord van de explantaten aan de rand van het trekkende ondergrond met behulp van een kleine plas media. Tot 1 ml van de cultuur media per rijstrook is voldoende om verdamping te voorkomen gedurende enkele uren, terwijl het beperken van beweging van de explantaten. Media formulering: Neurobasal met B-27 + 0,5 mm L-Glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) en 20 uM FDU + 20 uM Uridine mitotische remmers (F-0503, U-3003, Sigma). Bevestig het deksel en breng de bioreactor naar een incubator voor een uur of tot cellen hechten. Vul de bioreactor met cultuur media op het punt verste de explantaten om losraken te voorkomen. Incubeer de bioreactor voor een minimum van vijf dagen, terwijl neuronen uit te breiden axonale processen op de stationaire substraat. 4. Axon Stretch Groei De bioreactor ondergaat laatste voorbereiding procedures in een steriel kap: Vul reservoirs binnen de bioreactor met fosfaat gebufferde zoutoplossing om de kamer en beperken de verdamping van de cultuur media bevochtigen. In ons systeem, de uitgeholde behuizing muren dienen als reservoirs. Als alternatief kan petrischaaltje deksels worden geplaatst aan weerszijden van het trekkende blok boven op de cultuur van rijstroken. Vervang de cultuur media en vul de rijstroken van de capaciteit. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. Plaats de bioreactor in de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. Als het experiment moet worden uitgevoerd binnen een incubator, mag het niet worden bevochtigd vanwege mogelijke corrosie van de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. Bevestig het trekkende staaf-adapter op de trekhaak staven. Met behulp van Si Programmer software jog de fase van de lineaire beweging tafel aan te sluiten bij het trekkende roede adapter en het bevestigen aan het podium. Voor het gemak, voor te bereiden Si Programmeur sequenties van te voren om het podium te manipuleren in specifieke stappen. Draai de immobilisatie schroeven op de bioreactor kamer voor het vrije verkeer van het trekkende blok mogelijk te maken. Stretch wordt toegepast in een stapsgewijs door het initiëren van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al.. 2006). Onze paradigma begint met het nemen van 2 micrometer stappen per 172 seconden,resulterend in een netto-1mm strekken zich uit over 24 uur. Na een dag, kan het traject snelheid opgevoerd worden door verhoging van de verplaatsing of het verminderen van de dwell time (tabel 2). Zodra ASG is gestart, zijn media veranderingen meestal niet nodig. Na verloop van tijd echter, cultuur media wordt over het algemeen zuur en is duidelijk door een verandering in de geelachtige kleur. Als verdere experimenten nodig is, is oude media nooit helemaal leeg, maar in plaats daarvan slechts gedeeltelijk gewijzigd om trauma's te minimaliseren aan drijvende axonen. 5. Representatieve resultaten: Axonale processen kunnen ondergaan opvallend snelle en robuuste stretch groei. In eerste instantie het proces begint met een periode van trage rek (≤ 1mm/day) dat bestaat uit kleine, onregelmatige verplaatsingen. Binnen de eerste 24 uur na stretching, mechanotransductie van neuronale groei paden treedt, waarbij neuronen beginnen naast de axon cilinder. Binnen de 24 uur van continue ASG, axonen vertonen een toenemende tolerantie voor een grotere en meer frequente verplaatsingen. In het algemeen kan axonen bestand tegen een verhoging van de rek snelheid van 1mm/day iedere 12-24 uur (Pfister, Iwata et al., 2004;. Pfister, Bonislawski et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Het verhogen van de stretch rate te snel, kan echter leiden tot een snellere groei van axonen te selecteren, maar zal ook leiden tot pathologische occlusie dat afsluiting veroorzaakt. Stretch groeiende axonen hebben de neiging om bundels vormen, die lijkt op de architectuur van bundels. Gebruik te maken van de huidige protocollen, de centrale, stretch gegroeid deel van de axon bundels hebben geen verklevingen aan de cultuur substraat. Alleen de in eerste instantie aangehouden, proximale en distale segmenten van stretch groeiende axonen gehecht blijven aan de cultuur substraten. Dienovereenkomstig, het centrale gedeelte van stretch gegroeid axonen zweven vrij, en gevoelig zijn voor verstoring gevolge van het behandelen. Om verschillende redenen kunnen sommige axonen niet groeien in de toegepaste stretch tarief. Bijvoorbeeld, een DRG neuron met twee axonale processen, die beide ondergaan stretch, misschien niet in staat zijn om voldoende eiwit te vertalen en op de toegepaste tarief stuk groeien. Axonen, die niet geschikt voor de toegepaste stretch zullen dunne volgende effect Poisson's. Latere rekken zal leiden tot occlusie van de axonen, remmen assemblage, wat leidt tot pathologische verbroken. Het merendeel van de axonen, zijn echter in staat om te ondergaan ASG succesvol en slechts een klein percentage van de axonen ondergaan deze snoeien-achtig proces. Figuur 1. Axon Stretch groei Bioreactor System. (A) Bioreactor cultuur kamer & Automated lineaire beweging tafel, (B) Stap motor drive controller en Si Programming software. Figuur 2. Bioreactor Cultuur Kamer. Deze cartoon toont de bioreactor kamer van de top met verwijderde het deksel. De positie van het trekkende blok weerspiegelt het eindstadium van de axon stretch groei. Stretch uitgegroeid axonen kan gezien worden in bundels binnen de cultuur rijstroken. Figuur 3. Voedingssubstraat Plating Interface. Deze cartoon toont de componenten van het trekkende mechanisme in elke baan van de bioreactor van zijaanzicht. (Top) De correcte overlap van het trekkende en stationaire cultuur substraten. (Onder) Overmatige overlap van het trekkende en stationaire substraten zorgt ervoor dat de tip van het trekkende substraat te krullen. Film 1. Bevestigen van Cultuur Substraten voor Bioreactor Kamer. Klik hier om video te bekijken Movie 2. Plating van DRG Explantaten op Slepen Substrates. Klik hier om video te bekijken Movie 3. SiProgrammer gebruik. Klik hier om video te bekijken Movie 4. Groeikegel Uitbreiding op Stationaire Ondergrond. Klik hier om video te bekijken Movie 5. Axon Stretch Groei. Klik hier om video te bekijken Dag Stap 1 Sterilisatie & Drogen 2 Lijmen & Montage 4 Coatings & Neuronale Cultuur Plating 9 Stretch Groei Start Tabel 1. Experiment Schema. Tijd [hr] Stretch Prijs [mm / dag] Dwell Time [s] Totaal Lengte [mm] Totaal Stretch tijd [dagen] Pretentie 24 1 172,8 0 1 Uitrekken 24 1 172,8 1 2 Uitrekken 24 2 86,4 3 3 Uitrekken 24 3 57,6 6 4 Uitrekken 24 4 43,2 10 5 Uitrekken 24 5 34,6 15 6 Tabel 2. Stretch Rate Schema. Alle stretch stappen zijn 2 micrometer in verplaatsing (10 stappenmotor stappen = 2 micrometer stretch).