محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية
Summary
ووضعت هندسة الأنسجة طريقة فريدة لإطالة العديد من الألياف العصبية في الثقافة التي تلخص محوار نمو تمتد ؛ نموذج للنمو الجهاز العصبي حيث الأعصاب استطال بالتزامن مع نمو الجسم توسيع.
Abstract
خلال مرحلة ما قبل متشابك التطور الجنيني ، والعمليات العصبية اجتياز مسافات قصيرة للوصول إلى أهدافها عن طريق مخروط النمو. بمرور الوقت ، يتم فصل الخلايا العصبية من محطات somata محوار ، نظرا لنمو الهيكل العظمي للكائن توسيع (فايس 1941 ؛ رمادي ، Hukkanen وآخرون 1992). هذا يؤدي الى وضع mechanotransduction الثانوية للنمو الخلايا العصبية قادرة على استيعاب استطالة المستمر للمحوار (براي 1984 ؛ هايدمان وBuxbaum 1994 ؛ هايدمان ، لامورو وآخرون 1995 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2004).
محوار النمو الإمتداد (ASG) هو تصور عاملا أساسيا في نضج العمليات الجنينية قصيرة في الأعصاب طويلة ومساحات المادة البيضاء من سمات النظام العصبي البالغين. الأمين العام المساعد للدراسة في المختبر ، ونحن تصميم المفاعلات الحيوية لتطبيق التوتر على العمليات محواري قصيرة من الثقافات العصبية (Loverde ، Ozoka وآخرون 2011). هنا ، ونحن بالتفصيل الأساليب التي نستخدمها لإعداد المفاعلات الحيوية والسلوك أمين عام مساعد. أولا ، في كل حارة تمتد من مفاعل حيوي ، ومطلي الخلايا العصبية عند الركيزة a القطر الصغير التلاعب بها. المقبل ، تجديد الخلايا العصبية محواري عملياتها ، عبر تمديد مخروط النمو ، وعلى ركيزة ثابتة. أخيرا ، يتم تنفيذ النمو التي تمتد سحب جثث مطلي الخلية بعيدا عن محطات محوار انضمت إلى الركيزة الثابتة ؛ تلخص نمو الهيكل العظمي بعد التمديد مخروط النمو.
وقد أظهرت الأعمال السابقة أن جماعة أبو سياف من الفئران الجنينية الخلايا العصبية الظهرية العقد الجذرية القادرة على معدلات نمو غير مسبوقة تصل إلى 10mm/day ، حيث بلغت أطوال تصل إلى 10cm ، في حين أدى في الوقت نفسه زيادة في أقطار محواري (سميث وولف وآخرون 2001 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. فيستر Bonislawski وآخرون 2006 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2006 ؛ سميث 2009). هذا في تناقض مثير للتمديد مخروط النمو التجديدي (في غياب المحفزات الميكانيكية) حيث متوسط معدلات النمو 1mm/day مع التجديد الناجحة تقتصر على أطوال أقل من 3cm (فو وغوردون 1997 ؛. فيستر ، غوردون وآخرون 2011). وبالتالي يجوز إجراء مزيد من الدراسة لكشف الأمين العام المساعد مساعدة الآليات التي تحد من نمو dysregulated التجدد في ظل غياب المحفزات الميكانيكية.
Protocol
Discussion
ينبغي التقيد خطوتين حرجة خلال إعداد المفاعلات الحيوية. أولا ، هناك حاجة إلى وجود تداخل في واجهة مثالية لضمان الركيزة محاور عصبية يمكن أن يعبر على الركيزة الثابتة. وينبغي أن Aclar كرة لولبية بشكل مفرط أو غير ذلك الكمال لا يمكن استخدامها (الشكل 3). لتحسين التداخل ، تأكيد أن يتم غطى بالرمل الركيزة القطر بالتساوي والاتصالات الركيزة الثابتة بشكل موحد على مدى التصحيح 2 – 3mm الاتصال طويلة. وينبغي أن يكون الأمثل للتداخل قبل كل تجربة من خلال تعديل بعناية ارتفاع الساقين القطر.
الثانية ، في حين ينص على مرفق من الخلايا العصبية ، والطلاء الركيزة دعم قوات كبيرة sheering الناجمة عن النزوح من التوتر مفاعل حيوي ومقلص من المحاور (هايدمان وBuxbaum 1990 ؛ فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. Loverde ، Ozoka وآخرون 2011). وينبغي أن تشطف جيدا بالماء ركائز تعقيمها قبل وبعد طلاء يسين. ينبغي أن تطبق الطلاء من aliquots إذابة طازجة وموزعة بالتساوي قدر الإمكان. الأهم من ذلك ، ينبغي على ركائز لا يمكن نقله أو خلاف ذلك اضطراب خلال الفترة من الالتصاق. في خطوات لاحقة ، وتجنب الاتصال مع ركائز خلال الطلاء ، وجميع الحلول الماصة من نهاية بكثير من الممرات بعيدا عن واجهة الركيزة.
يمكن التحمل في الاتصالات من كل مكون مفاعل حيوي واضح في شكل الركود. خلال الفترة الأولى من جماعة أبو سياف ، الترهل في النظام كما يتضح من الجدول الحركة الحركة الخطية الآلي يحدث دون وجود تحرك للكتلة السحب. يمكن أن تختلف والترهل في التجربة ، بل هو عادة <1MM في تجربتنا. لهذا السبب ، وهو "ما قبل التوتر" مرحلة التخلص من الترهل 1mm/day ، ليوم واحد يسبق الجدول الزمني للجماعة أبو سياف خلالها أجزاء مفاعل حيوي والبدء في إشراك حركة ركائز القطر.
قد تكون مطلوبة لحل المشاكل إذا كانت الخطوة تشريد الجدول الحركة الخطية الآلي لا يطابق تشريد كتلة السحب بعد مرحلة ما قبل اكتمال التوتر. وترتبط متزامنة ، وتشريد غير دقيقة للكتلة السحب مع 'stiction' أو الاحتكاك ثابت داخل أجهزة السحب والثناء من المحول. لمنع حدوث هذه القضايا ، ينبغي التحقق من كتلة حركة السحب من جهة ، وبعد التجميع ، على حركة شبه سهل سلس. إذا ملزم يحدث ، ينبغي الافراج عن التجمع القطر قبل التجريب. صلابة كافية لمحول من الضروري أيضا ضمان دقة ، وتشريد متزامن لم يتم التغلب بواسطة stiction للأجهزة السحب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق التوظيف NSF CBET – 0747615. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. دوجلاس سميث وديفيد لMeaney F. الإرشاد والدعم.
Materials
| Name of component | Company | Catalogue number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD, Bedford, MA | 354210 |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O’Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
