Выделение Брейн-Лейкоциты проникают
Summary
Быстрый метод получения проникновения лейкоцитов из мышиного мозга описывается. Этот метод использует непрерывный градиент Перколла и разрывные градиент Ficoll, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов обогащенного слоя. Изолированные лейкоцитов может затем быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии измерений.
Abstract
Мы опишем способ получения мозг проникают лейкоциты (BILS) от мышей. Мы показываем, как заразить мышей с мышиным энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) с помощью быстрой внутричерепного технике инъекций и как очистить лейкоцитов обогащенного населения проникают клетки весь мозг. Короче говоря, мышей анестезировали изофлуран в закрытой камере, и от руки вводят с помощью шприца Гамильтона в лобной коре. Мыши затем убили в разное время после заражения изофлуран передозировки и весь мозг извлекаются и гомогенизировали в RPMI с мясорубки ткани Tenbroeck. Мозг гомогенатах центрифугируют через непрерывный 30% Перколла градиента, чтобы удалить миелина и другой клетке мусора. Клеточной суспензии затем напряженными при 40 мкм, промывают и центрифугируют на разрывной Ficoll-Paque Плюс градиента, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов. Лейкоциты, затем промывали и ресуспендировали в соответствующие буферы для иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия выявляет населения врожденных иммунных клеток на ранних стадиях инфекции в C57BL / 6 мышей. Через 24 часа после инфекции, несколько подмножеств иммунные клетки присутствуют в BILS, с населением обогащенных Gr1 +, CD11b + и F4/80 + клеток. Таким образом, этот метод полезен при характеристике иммунного ответа на острую инфекцию в мозгу.
Protocol
Discussion
Мы регулярно пользоваться проточной цитометрии для определения как качества мозг проникают ячейки подготовки, и различать различные популяции иммунных клеток, 2, 9. При острых временных точках, наши BILS метод дает высокий процент воспалительных моноцитов в CD45hi населения, а также в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NS64571 от NINDS (CLH), на ранних награду развития карьеры из клиники Майо (CLH), а щедрый подарок от Дональда и Фрэнсис Herdrich (CLH). Мы хотели бы поблагодарить потока клиники Майо цитометрии основной для получения помощи.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
