A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel
Summary
Nós projetamos um ensaio de receptor de células livres vinculativas, a fim de estimar a ligação de granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia (GM-CSF) para os receptores. Ele nos permite avaliar inibição competitiva do biotinilado GM-CSF ligação a solúvel GM-CSF receptor alfa por GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade.
Abstract
FUNDOS: Anteriormente, demonstramos que a capacidade de neutralizar, mas não a concentração de GM-CSF auto-anticorpos foi correlacionada com a severidade da doença em pacientes com proteinose alveolar pulmonar auto-imunes (PAP) 1-3. Como revogação da GM-CSF bioatividade no pulmão é a causa mais provável para PAP auto-imunes 4,5, é promissora para medir a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos para avaliar a gravidade da doença em cada paciente com PAP.
Até agora, a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos foi avaliada através da avaliação da inibição do crescimento de células de medula óssea humana ou TF-1 células estimuladas com GM-CSF 6-8. No sistema de bioensaio, no entanto, muitas vezes é problemático para obter dados fiáveis, bem como comparar os dados de diferentes laboratórios, devido a dificuldades técnicas na manutenção das células em uma condição constante.
OBJETIVO: Para imitar GM-CSF ligação ao GM-CSF receptor na superfície celular utilizando células livres receptor-ensaio de ligação.
MÉTODOS: Transgênicos bicho-da-tecnologia foi aplicada para a obtenção de uma grande quantidade de recombinante solúvel GM-CSF receptor alfa (sGMRα) com alta pureza 9-13. O sGMRα recombinante foi contido nas camadas sericin hidrofílica de fios de seda sem ser fundida ao proteínas da seda, e assim, podemos facilmente extrair os casulos na pureza bom com soluções aquosas neutras 14,15. Felizmente, as estruturas de oligossacarídeos, que são críticos para a ligação com a GM-CSF, são mais semelhantes às estruturas de sGMRα humana do que aquelas produzidas por outros insetos ou leveduras.
RESULTADOS: O sistema de ensaio livre de células usando sGMRα rendeu os dados com alta plasticidade e confiabilidade. GM-CSF ligação a sGMRα foi dose-dependente inibida por policlonal GM-CSF auto-anticorpos de forma semelhante ao bioensaio usando TF-1 células, indicando que o nosso novo livre de células do sistema de ensaio utilizando sGMRα é mais útil para a medição da atividade neutralizante de GM-CSF auto-anticorpos que o sistema de bioensaio utilizando TF-1 célula ou células humanas de medula óssea.
CONCLUSÕES: Nós estabelecemos um ensaio livre de células quantificar a capacidade de neutralização da GM-CSF auto-anticorpos.
Protocol
Discussion
O ensaio livre de células estimou a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade e rapidez. A inibição de ligação por auto-anticorpos GM-CSF ou frações de soro do paciente IgG foi avaliada por este ensaio. Os dados mostraram uma correlação entre a inibição de ligação do ensaio livre de células ea inibição do crescimento de um bioensaio utilizando células TF-1, respectivamente. O bioensaio tem sido amplamente utilizada, mas abrigava dificuldades na comparação …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muito gratos a K. Nakagaki, H. Dr. Ishii, Dr. K. Suzuki, Yamagata A., K. Oofusa por suas valiosas contribuições.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
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