Assay חינם Cell מערכת הערכת קיבולת נטרול של נוגדן GM-CSF באמצעות קולטן מסיס רקומביננטי GM-CSF
Summary
עיצבנו assay תא ללא קולטן מחייב כדי לאמוד את הכריכה של גורם המושבה מגרה granulocyte-מקרופאג (GM-CSF) לקולטנים. זה מאפשר לנו להעריך עיכוב תחרותי של biotinylated GM-CSF מחייב מסיסים GM-CSF קולטן אלפא ידי GM-CSF autoantibody עם reproducibility מעולה.
Abstract
רקע: בעבר, הראינו כי יכולת נטרול אך לא את הריכוז של GM-CSF autoantibody היתה בקורלציה עם חומרת המחלה בחולים עם proteinosis אוטואימוניות מכתשיים ריאתי (PAP) 1-3. כפי וביטול bioactivity GM-CSF בריאה היא הגורם סביר PAP אוטואימוניות 4,5, הוא מבטיח למדוד את יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים להערכת חומרת המחלה על כל חולה עם PAP.
עד עכשיו, יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים כבר העריכו ידי הערכת עיכוב הצמיחה של האדם תאים במח העצם או TF-1 תאים מגורה עם GM-CSF 6-8. במערכת המבדק, לעומת זאת, הוא לעתים קרובות בעייתי לקבל נתונים אמינים כמו גם להשוות את הנתונים ממעבדות שונות, בשל קשיים טכניים בשמירה על תאים במצב קבוע.
המטרה: לחקות GM-CSF מחייב לקולטן GM-CSF על פני התא באמצעות קולטן תא-free-binding-assay.
שיטות: טראנסגנטי תולעי משי הטכנולוגיה יושמה לקבלת כמות גדולה של מסיס רקומביננטי GM-CSF קולטני אלפא (sGMRα) עם הטוהר גבוהה 9-13. SGMRα רקומביננטי היה הכלולים שכבות sericin הידרופילי של חוטי משי מבלי התמזגו את החלבונים משי, ולכן, אנחנו יכולים בקלות לחלץ מתוך פקעות של טוהר טוב עם תמיסות מימיות נייטרלי 14,15. למרבה המזל, מבנים oligosaccharide, אשר הם קריטיים עבור מחייב עם GM-CSF, דומים יותר מבני האדם sGMRα מאלה המיוצרים על ידי חרקים או שמרים אחרים.
תוצאות: מערכת תא ללא assay באמצעות sGMRα הניבו את הנתונים עם הפלסטיות אמינות גבוהה. GM-CSF מחייב sGMRα היה במינון dependently מעוכבים על ידי autoantibody polyclonal GM-CSF באופן דומה המבדק באמצעות TF-1 תאים, המציין כי חדש ללא התא שלנו assay המערכת באמצעות sGMRα שימושית יותר למדידת פעילות נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים מאשר מערכת המבדק באמצעות TF-1 או תא אנושי לתאי מח עצם.
מסקנות: הקמנו assay תא ללא לכימות יכולת נטרול של GM-CSF autoantibody.
Protocol
Discussion
Assay תא ללא העריכו את יכולת נטרול של GM-CSF נוגדנים עצמיים עם שחזור המהירות מעולה. עיכוב הכריכה על ידי GM-CSF או שברים נוגדנים עצמיים בסרום של החולה IgG הוערך על ידי assay זה. הנתונים הראו מתאם בין עיכוב המחייב של assay התא חינם ועל עיכוב הצמיחה של המבדק באמצעות TF-1 תאים, בהתאמה. המבד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד ק Nakagaki, ד"ר ח אישיאי, ד"ר ק 'סוזוקי, א Yamagata, ק Oofusa תרומות יקר שלהם.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
