نظام خلية الفحص مجاني تقدير تحييد القدرات من GM - CSF جسم باستخدام المؤتلف ذوبان GM - CSF مستقبلات
Summary
قمنا بتصميم تجربة خالية من الخلايا مستقبلات ملزمة من أجل تقدير الربط عامل تحفيز مستعمرة محببة – البلاعم (GM – CSF) إلى المستقبلات. انها تمكننا من تقييم التثبيط التنافسي للbiotinylated GM – CSF ملزم لمستقبلات ألفا للذوبان GM – CSF – CSF من قبل جنرال موتورز مع الأجسام المضادة استنساخ ممتازة.
Abstract
الخلفيات : في السابق ، ونحن أثبتت أن القدرة على تحييد لكنه لا يرتبط تركيز الأجسام المضادة GM – CSF مع شدة المرض في المرضى الذين يعانون من المناعة الذاتية البروتيني السنخي الرئوي (PAP) 1-3. وإلغاء النشاط الحيوي GM – CSF في الرئة هو السبب المرجح لPAP 4،5 المناعة الذاتية ، فهو يبشر بالخير لقياس قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة – CSF لتقييم شدة المرض في كل مريض مع PAP.
حتى الآن ، وقد تم تقييم قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة – CSF من خلال تقييم تثبيط نمو خلايا نخاع العظام أو خلايا TF – 1 حفز مع GM – CSF 6-8. في النظام الأحيائي ، ومع ذلك ، غالبا ما يكون مشكلة للحصول على بيانات موثوق بها وكذلك للمقارنة بين البيانات المأخوذة من مختلف المختبرات ، وذلك بسبب الصعوبات التقنية في الحفاظ على الخلايا في حالة ثابتة.
الهدف : محاكاة GM – CSF ملزم لمستقبلات GM – CSF على سطح الخلية باستخدام خالية من الخلايا مستقبلات ملزمة مقايسة.
تم تطبيق تكنولوجيا المعدلة وراثيا دودة القز من أجل الحصول على مبلغ كبير بالنسبة لالمؤتلف مستقبلات ألفا للذوبان GM – CSF (sGMRα) مع درجة نقاوة عالية 9-13 : طرق. وكان يرد sGMRα المؤتلف في الطبقات المائية سيريسين من الخيوط الحريرية دون تنصهر للبروتينات الحرير ، وبالتالي ، يمكننا بسهولة استخراج من الشرانق في الطهارة جيدة مع المحاليل المائية المحايدة 14،15. لحسن الحظ ، فإن الهياكل oligosaccharide ، التي هي حيوية للربط مع GM – CSF ، أكثر مشابهة للهياكل sGMRα الإنسان من تلك التي تنتجها الحشرات الأخرى أو الخمائر.
النتائج : نظام مقايسة خالية من الخلايا باستخدام sGMRα أسفرت البيانات مع مرونة وموثوقية عالية. وكان GM – CSF ملزمة لsGMRα الجرعة بشكل تابع تثبطها الأجسام المضادة GM – CSF النسائل المتعددة بطريقة مشابهة لما الأحيائي باستخدام الخلايا TF – 1 ، مشيرا إلى أن لدينا نظام جديد خالية من الخلايا باستخدام مقايسة sGMRα هو أكثر فائدة لقياس النشاط تحييد GM – CSF من الأجسام المضادة من النظام الأحيائي باستخدام TF – 1 خلية أو خلايا نخاع العظام.
الاستنتاجات : نحن إنشاء مقايسة خالية من الخلايا قياس قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة – CSF.
Protocol
Discussion
قدرت مقايسة خالية من الخلايا تحييد قدرة جنرال موتورز – CSF الأجسام المضادة مع استنساخ ممتازة وسرعة. تم تقييم تثبيط ملزم من قبل جنرال موتورز – CSF الأجسام المضادة أو المريض المصل الكسور مفتش بواسطة هذا الاختبار. وأظهرت البيانات وجود ارتباط بين تثبيط ملزم للمقايسة خالية م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون جدا لNakagaki K. ، الدكتور إيشي H. ، الدكتور سوزوكي K. ، ياماغاتا A. ، K. Oofusa لما قدموه من مساهمات قيمة.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5′-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
