"Bioluminescent" כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים
Summary
שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי של<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Pestis Yersinia ו anthracis Bacillus הם קטגוריה פתוגנים חיידקיים כי הם סוכני סיבתי של המגיפה ואת אנתרקס, בהתאמה 1. למרות התרחשות טבעית של שתי מחלות "כיום נדיר יחסית, את האפשרות של קבוצות טרור באמצעות אלה פתוגנים כמו bioweapon הוא אמיתי. בגלל communicability הטבועה של המחלה, כמובן קליניים מהירה, שיעור תמותה גבוה, זה קריטי, כי התפרצות להתגלות מהר. לכן מתודולוגיות המספקים איתור אבחון מהיר חיוניים על מנת להבטיח יישום מיידי של צעדים לבריאות הציבור ההפעלה של ניהול משברים.
רקומביננטי phage הכתב עשוי לספק גישה מהירה ספציפי לגילוי של י ' pestis ו-B anthracis. המרכז לבקרת מחלות ומניעתן משתמש כעת תמוגה מבחני קלאסית phage לזיהוי אישר אלה חיידקים פתוגנים 2-4. מבחני אלו לנצל טבעי phage שהם ספציפיים ממס עבור המארחים חיידקי שלהם. לאחר לילה צמיחה של החיידק מעובדים בנוכחות phage הספציפי, היווצרות הפלאק (תמוגה חיידקי) מספק זיהוי חיובי של יעד חיידקי. למרות מבחני האלה הם חזקים, הם סובלים משלושה חסרונות: 1) הם המעבדה מבוססת, 2) הם דורשים בידוד טיפוח חיידקים מן המדגם חשד, ו 3) הם לוקחים 24-36 שעות כדי להשלים. כדי לטפל בבעיות אלה, רקומביננטי "אור מתויג" phage הכתב היו מהונדסים גנטית על ידי שילוב harveyi Vibrio luxAB גנים לתוך הגנום של י ' pestis ו-B anthracis phage ספציפי 5-8. הכתב כתוצאה phage luxAB הצליחו לזהות יעד ספציפי שלהם במהירות (תוך דקות) וברגישות הענקת פנוטיפ bioluminescent לתאי הנמען. חשוב לציין, זיהוי הושג גם עם תאים הנמען מעובדים או עם מעושה נגוע דגימות קליניות 7.
למטרות הדגמה, כאן אנו מתארים את השיטה לגילוי phage בתיווך של י ידוע pestis לבודד באמצעות phage כתב luxAB בנויים המגפה CDC אבחון phage ΦA1122 6,7 (איור 1). שיטה דומה, עם שינויים קלים (למשל שינוי הטמפרטורה צמיחה התקשורת), ניתן להשתמש לצורך זיהוי של B. anthracis מבודד באמצעות B. phage anthracis Wβ כתב: luxAB 8. השיטה מתארת את התמרה phage בתיווך של פנוטיפ biolumescent י 'טיפח pestis התאים הנמדדים לאחר מכן באמצעות luminometer microplate. היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני מבחני תמוגה המסורתית הפאג הוא קלות השימוש, התוצאות מהירה, את היכולת לבחון דגימות בו זמנית בפורמט 96-microtiter גם צלחת.
באיור 1. סכמטית איתור. Phage מעורבבים עם המדגם, phage מדביק את התא, luxAB באים לידי ביטוי, ואת bioluminesces התא. עיבוד המדגם אינו הכרחי; phage ותאי מעורבבים ומדד לאחר מכן לאור.
Protocol
Discussion
שיטה זו ממחישה את יכולתו של הפאג הכתב כדי לזהות במהירות Y. pestis מאז phage הכתב יכול transduce תגובה bioluminescent האות י 'תרבותי pestis תאים בתוך 20 דקות אחרי כן phage. Phage עיתונאי הוא גם מסוגל לזהות ישירות י pestis ב מטריצות קליני, ללא תנאי מוקדם של בידוד 7 הטיפוח הבאים. ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר קטן חדשנות עסקית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIAID, 1R43AI082698-01) ו – USDA המכון הלאומי של המזון והחקלאות (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. . Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).
- . . , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. . CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
