'Bioluminescent' Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Yersinia pestis en Bacillus anthracis zijn categorie A bacteriële ziekteverwekkers die de verwekkers van de pest en anthrax, respectievelijk ^1. Hoewel de natuurlijke aanwezigheid van beide ziekten 'is nu relatief zeldzaam, de mogelijkheid van terroristische groeperingen gebruik van deze pathogenen als een biowapen is echt. Vanwege de ziekte die inherent zijn besmettingsgevaar, snelle beloop, en een hoge mortaliteit, is het essentieel dat een uitbraak snel kan worden opgespoord. Daarom methodologieën die een snelle opsporing en diagnose te bieden zijn essentieel voor de onmiddellijke uitvoering van public health maatregelen en de activering van de crisisbeheersing te garanderen.

Recombinant verslaggever faag kunnen voorzien in een snelle en specifieke aanpak voor de detectie van Y. pestis en B. anthracis. De Centers for Disease Control and Prevention op dit moment gebruik maken van de klassieke faag lyse assays voor de bevestigde identificatie van deze bacteriële pathogenen ^2-4. Deze testen profiteren van natuurlijk voorkomende faag, die specifieke en lytische zijn voor hun bacteriële gastheren. Na een nacht groei van de bacterie gekweekt in de aanwezigheid van de specifieke faag, de vorming van plaques (bacteriële lysis) biedt een positieve identificatie van de bacteriële doel. Hoewel deze tests zijn robuust, ze lijden aan drie tekortkomingen: 1) ze zijn laboratorium gebaseerd zijn, 2) ze vereisen bacteriële isolatie en kweek van het verdachte monster, en 3) zij nemen 24 tot 36 uur om te voltooien. Om deze problemen werden recombinant "light-tag" reporter faag genetisch gemanipuleerde door het integreren van de Vibrio harveyi luxAB genen in het genoom van Y. pestis en B. anthracis specifieke faag ^5-8. De resulterende luxAB reporter faag waren in staat om hun specifieke doelgroep te detecteren door snel (binnen een paar minuten) en gevoelig verlenen van een bioluminescente fenotype aan ontvanger cellen. Belangrijk is dat detectie verkregen, hetzij met gekweekte cellen of de ontvanger met een mock-geïnfecteerde klinische monsters ^7.

Ter demonstratie, hier beschrijven we de methode voor de faag-gemedieerde detectie van een bekende Y. pestis isoleren met behulp van een luxAB reporter faag opgebouwd uit de CDC pest diagnostische faag ΦA1122 ^6,7 (figuur 1). Een vergelijkbare methode, met kleine wijzigingen (bv. verandering in de groei temperatuur en media), kan worden gebruikt voor de detectie van B. anthracis isolaten, met behulp van de B. anthracis verslaggever faag Wβ:: luxAB ^8. De methode beschrijft de faag-gemedieerde transductie van een biolumescent fenotype aan gecultiveerde Y. pestis cellen die vervolgens worden gemeten met behulp van een microplaat luminometer. De belangrijkste voordelen van deze methode boven de traditionele faag lysis assays is het gebruiksgemak, de snelle resultaten en de mogelijkheid om gelijktijdig te testen meerdere monsters in een 96-well microtiterplaat-formaat.

Figuur 1. Detectie schema. De faag worden gemengd met het monster, de faag infecteert de cel, luxAB worden uitgedrukt, en de cel bioluminesces. Monster verwerking is niet noodzakelijk, de faag en cellen worden gemengd en vervolgens gemeten voor licht.