Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

1. DC nucleofection Урожай моноцитарных контроллеры домена, которые были обогащены с использованием пластиковых приверженности, культивировали в течение 5 дней с помощью сотового Genix среде с IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) и далее созрел в течение 24 часов использования созревания DC цитокинов IL4 (1000U / мл), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml и PGE2 (1μg/ml) 1, нежным ресуспендирования с 3 мл пипетки передачи. Граф жизнеспособной контроллеры домена с использованием трипанового синий, передачи в 3-кратным 15 мл пробирки с не менее чем 0.5×10 6 и не более 2х10 6 кл / трубы. Центрифуга для РС 10mins @ 200г. За это время предварительно теплой сотовый Genix среде с созреванием DC цитокинов (СМИ DC созревания) – 2ml/well в трех скважинах 12-а тканевая культура рассматривается пластины в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора. Как только клетки закончили спиннинг, аспирация супернатант и добавить соответствующие плазмиды ДНК, чтобы каждый из трубы в конечной концентрации 5 мкг ДНК / трубы. В этом случае добавить плазмиды, кодирующей IE1-РР65 к трубе № 1, Hexon-Пентон к трубе № 2, и EBNA1-LMP2-BZLF1 к трубе № 3. Ресуспендируют ДК и ДНК с 100 мкл раствора nucloefection Amaxa, хорошо перемешать и трансфер в nucleofection кювет. Место в кювет 4D nucleofector, выберите программу CB150 (Amaxa / Lonza), и нажать старт. Сразу же после nucleofection добавить 500 мкл в 2 мл подогретого сотовый Genix DC созревания СМИ кюветы, аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 2-3 раза, и передача nucleofected РС подготовлена ​​12-луночного планшета содержащих оставшиеся 1,5 мл предварительно нагретого СМИ DC созревания. Трансфер в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора для дальнейшей 12-18hrs. 2. Т-клеток, стимуляция Урожай и считать nucleofected контроллеры домена, и облучать на 30Gy. Вымойте раз с 10 мл среды CTL (45% RPMI, 45% кликов EHAA, 10% ЭТС, 2мм Glutamax) и ресуспендируйте @ 3 х 10 5 контроллеров домена на мл CTL СМИ. Бассейн минимум 7.5×10 5 (2,5 мл) и максимум 15×10 5 (5 мл) ДК содержащие каждый из плазмид и передача объединенных РС G-Rex устройства, которые затем будут помещены в инкубатор. Для подготовки клетки ответчик использовать либо ранее замороженных МНПК или не соблюдают мононуклеарных клеток, которые остаются после выбора постоянного тока (следование или CD14 выбор). Оттепель клетки, трансфер в нагретого культуральной среде, мыть один раз с CTL СМИ. Ресуспендируют клеток в СМИ CTL, граф клеток и довести их до концентрации 2х10 6 клеток на мл. Возьмите 15×10 6 ячеек или 7.5ml и дополнения 30000U IL4 (1000U/ml -. Окончательным концом) и 300ng IL7 (10ng/ml – финальный конц.). Передача 7.5ml из РВМС (15×10 6 ячеек) для G-Rex и пополнить биореактор с CTL СМИ, чтобы общий объем 30 мл. Культура G-Rex в течение 6-7 дней при 37 ° С / 5% CO 2 увлажненный инкубатора. 3. Т-клеток расширения В день 6-7, 10 мл аспирата средств массовой информации, затем смешать клетки в оставшихся 20 мл среды с 10 мл пипетки и считать жизнеспособных клеток с трипановым синий. Если Есть <50×10 6 пополнится свежим медиа + цитокинов. Если Есть> 50×10 6 ячеек удалить 10 мл клеточной суспензии, переезд в новый G-Rex, а затем кормить как G-Rexs со свежими CTL СМИ + цитокинов. Культура для дополнительных 4-6 дней. После достаточного клетки были расширены, выполните фенотипические и функциональные характеристики CTL и cryopreserve избыток для будущего использования. 4. Представитель Результаты: Схема нашей FDA утвержденных multivirus конкретных CTL процесса генерации показано на рисунке 1. В отличие от конвенции multivirus CTL протоколы, которые используют adenovectors и EBV-LCL, чтобы стимулировать вирус-реактивных Т-клеток, 2 мы пришли на смену инфекционным материалом вируса с ДНК плазмиды , которые кодируют несколько антигенов производным от каждого из вирусов 3. Чтобы стимулировать trivirus CTL, нами разработаны три multicistronic плазмид кодирования Hexon и Пентон аденовируса, IE1 и РР65 ЦМВ, и EBNA1, LMP2, а BZLF1 ВЭБ. Эти антигены были выбраны на основе поощрения клинические результаты наших собственных и других групп, показывающие, что Т-клетки, направленный против Adv-hexon и Пентон 2,4-6, а также ЦМВ-1E1 и ЦМВ РР65 являются защитными в естественных условиях 7. Для EBV, EBNA1 является иммунодоминантные CD4 + T-клетки-мишени антиген экспрессируется во всех EBV-связанных злокачественных опухолей и в нормальных ВЭБ-инфицированных клеток 8,9, LMP2 является иммуногенной на несколько типов HLA и выражается в самых EBV злокачественных новообразований, в то время как 10,11 BZLF1 кодирует иммунодоминантные, немедленное рано литического цикла антиген, который стимулирует CD4 + и CD8 + Т-клеток от большинства людей и, вероятно, важна для сотрудничестваntrol клеток репликация вируса 12. Для дальнейшей оптимизации наших методов производства мы сотрудничали с природой технологий, создавшим minimalized, антибиотиков (FDA-совместимый) плазмиды для стимуляции ЦТЛ 13,14. С помощью этой стратегии мы последовательно достичь nucleofection КПД> 35% при сохранении высокой жизнеспособности клеток (данные не представлены) 3. Рисунок 2 показывает, что частота вирус-специфических Т-клеток в ответ на оптимизированных плазмиды ДНК, как измеряется IFNγ ELISpot, было больше, , чем в ответ на обычные pShuttle основе плазмиды экспрессии выражения же антигены (п = 8 аденовирус, п = 4 ЦМВ, и п = 2 EBV). Оптимальное соотношение DC: РВМС было важно для мощных стимуляция Т-клеток, как показано на рисунке 3, где отношение 1:50 производятся неоптимальной активации по сравнению с 1:20 S: R отношение (п = 2 доноров). Производство достаточного CTL номера с широкими специфичность антигена предпосылкой для клинической эффективностью против всех трех вирусов. Это достигается за счет CTL культуры в G-Rex, которая поддерживает превосходные Т расширение ячейки по сравнению с обычными 24-луночных планшетах (рис. 4а) 15, в то время как добавление IL4 и IL7 к культурам увеличивает репертуар и специфичность как показано на рисунке 4В где частота Т-клеток, реактивная против ЦМВ РР65 полученных HLA-A2 resticted NLV пептид был оценен в культурах, генерируемых в присутствии или отсутствии IL4 и / или IL7 16,17. Для оценки фенотипа и функциональных возможностей расширен клетки мы проводим проточной цитометрии анализа внутриклеточных цитокинов окрашивания / IFNγ ELISpot и Cr 51 анализов релиз на конечный продукт для криоконсервации / в инфузии. Обычно сгенерированный клетки поликлональных со смешанным населением CD4 + и CD8 + Т-клеток с антигеном-специфичность обнаруживается в обоих отсеках Т клетки. CTL способны убить вирусный антиген-клеток, экспрессирующих цели, но не вирус отрицательный частично HLA соответствие цели, указывая, что они не должны вызывать трансплантат против хозяина (GVHD) в естественных условиях (рис. 5). Рисунок 1. RCTL поколение протокола. Во-первых, контроллеры домена являются nucleofected с вирусного антигена кодирования плазмиды и затем смешивается с аутологичной МНПК на R: S 10 или 20:1. Клетки разлагаются в G-Rex в течение 10-14 дней в присутствии IL4 и IL7, затем собирают, считая, проверены на функции, идентичность и стерильность, а затем криоконсервированных для клинического использования. Рисунок 2. Оптимизированная плазмид ДНК вызывают превосходной активацию Т-клеток в пробирке. Контроллеры домена были nucleofected с оптимизированной, FDA-совместимые плазмиды кодирования Hexon и Пентон (Adv), IE1 и РР65 (ЦМВ), и EBNA1, LMP2, а BZLF1 (ВЭБ) или обычные плазмиды pShuttle кодирования же антигены. Они были использованы, чтобы стимулировать Т-клетки и специфичность была проанализирована IFNγ ELISpot 10 дней после стимуляции. Рисунок 3 Оптимальное DC:. Соотношение T ячейки для CTL активации. Контроллеры домена от 2 доноров nucleofected со всеми тремя оптимизированы плазмид, а затем используются для стимуляции аутологичных МНПК в 1:20 или 1:50 DC: РВМС отношение. Частота реактивации Т-клеток была оценена на 10 день от IFNγ ELISpot. Рисунок 4. Т-клеток расширение G-Rex использованием повышения цитокинов. Группа показывает, G-Rex устройства, а также появление на CTL мембраны газопроницаемых, оценивали с помощью микроскопа. Сравнение между сотовыми выход, достигнутых в культуре ткани конвенции рассматриваются пластины против G-Rex также показано на рисунке. Группа B показывает частоту ЦМВ пентамера положительные CTL, достигнутые в культурах расширен в наличии не цитокинов, IL4 один, IL7 один и IL4 + IL7. Рисунок 5. Фенотип и функции расширенного CTL. Группа показывает типичный пример фенотип расширен CTL multivirus, которые поликлональных смесью CD4 + (45% – помощник) и CD8 + (42% – цитотоксические) Т-клетки, из которых большинство (95%) выразили памяти маркер CD45RO + / CD62L +. Группа B показывает, что эти клетки являются специфическими для всех стимулирующих антигенов и полифункциональных по оценке внутриклеточного окрашивания цитокинов обнаружить производства IFNΓ и ФНО после антигена стимуляции. группы С показывает, что расширил CTL, являются действительными измеряется по 51 Cr анализа. Аутологичная LCL, либо самостоятельно, либо трансдуцированных с нулевого вектора или аденовирусного вектора выражения ЦМВ РР65 были использованы в качестве смолыполучает. Alloreactivity оценивалась с использованием аллогенных PHA взрывы в качестве мишени.