Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

1. DC nucleofection Harvest DC derivate da monociti, che sono stati arricchiti con l'adesione di plastica, colta per 5 giorni utilizzando cellule Genix multimediale integrato con IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) e ulteriormente stagionato per 24 ore utilizzando le citochine maturazione DC IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml e PGE2 (1μg/ml) 1, dalla risospensione dolce con una pipetta di trasferimento da 3 ml. Conte DC praticabile con trypan blu, trasferimento in 3x tubi 15ml con non meno di 0.5×10 6 e non più di 2×10 6 cellule / tubo. Centrifugare per 10 minuti DC @ 200g. Durante questo periodo di pre-riscaldare cella Genix multimediali integrate con citochine maturazione della DC (media maturazione DC) – 2ml/well in tre pozzi di un 12-e colture di tessuti trattati piastra a 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. Una volta che le cellule hanno finito di girare, aspirare il supernatante e aggiungere i plasmidi DNA relativi a ciascuno dei tubi in una concentrazione finale di DNA 5μg / tubo. In questo caso aggiungere la codifica plasmide IE1-pp65 al tubo # 1, Hexon-Penton al tubo # 2, e EBNA1-LMP2-BZLF1 per tubo # 3. Risospendere DC e del DNA con 100μl di soluzione nucloefection Amaxa, mescolare bene e trasferimento in cuvette nucleofection. Cuvette posto nella nucleofector 4D, scegliete programma CB150 (Amaxa / Lonza), e premere start. Immediatamente dopo nucleofection aggiungere 500μl di 2 ml preriscaldata cella Genix dei media maturazione DC alla cuvetta, mescolare delicatamente pipettando su e giù per 2-3 volte, e DC trasferimento nucleofected al preparato 12-pozzetti contenenti il ​​restante 1,5 ml di preriscaldata DC maturazione media. Trasferimento ai 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per un ulteriore 12-18hrs. 2. Stimolazione delle cellule T Raccolta e il conteggio DC nucleofected, e irradiare a 30Gy. Lavare una volta con 10 ml di medium CTL (45% RPMI, 45% clic EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) e risospendere @ 3 x 10 5 DC per ml di mezzi di CTL. Piscina un minimo di 7.5×10 5 (2,5 ml) e un massimo di 15×10 5 (5 ml) di DC contenenti ognuno dei plasmidi e trasferire la DC in pool per la G-Rex dispositivo che sarà posto in incubatrice. Per la preparazione delle cellule responder utilizzare PBMC precedentemente congelate o cellule mononucleari non aderente che rimangono dopo la selezione DC (aderenza o CD14 selezione). Scongelare le cellule, trasferimento al terreno di coltura preriscaldata, lavare una volta con i media CTL. Risospendere le cellule in Media CTL, contare le cellule e portarli a una concentrazione di 2×10 6 cellule per ml. Prendere 15×10 6 celle o 7.5ml e integrare con 30000U IL4 (1000U/ml -. Conc finale) e 300ng IL7 (10ng/ml – conc finale.). Trasferimento 7.5ml di PBMC (15×10 6 celle) al G-Rex e rabboccare il bioreattore con i media CTL per un volume totale di 30ml. Cultura del G-Rex per 6-7 giorni a 37 ° C / 5% CO 2 incubatore umidificato. 3. L'espansione delle cellule T Il giorno di 6-7, 10ml aspirato di media, poi mescolare le cellule del restante 20 ml di media con una pipetta da 10 ml e conta delle cellule vitali con trypan blu. Se ci sono <50×10 6 ricostituire con mezzi freschi + citochine. Se ci sono> 50×10 6 celle rimuovere 10 ml di sospensione cellulare, trasferimento in un nuovo G-Rex, e quindi alimentazione sia G-Rexs fresca mezzi CTL + citochine. Cultura per altri 4-6 giorni. Una volta che le cellule sufficiente sono stati ampliati, eseguire la caratterizzazione fenotipica e funzionale del CTL in eccesso e crioconservare per un uso futuro. 4. Rappresentante dei risultati: Uno schema del nostro approvato dall'FDA multivirus specifico processo di generazione CTL è illustrato nella figura 1. A differenza di convenzione multivirus CTL protocolli che utilizzano adenovectors e EBV-LCL per stimolare virus cellule T reattive 2 abbiamo sostituito con materiale infetto da virus plasmidi DNA che codificano antigeni multipli derivati ​​da ciascuno dei virus 3. Per stimolare CTL trivirus abbiamo progettato tre multicistronic plasmidi codifica Hexon e Penton di adenovirus, IE1 e pp65 del CMV, e EBNA1, LMP2 e BZLF1 di EBV. Questi antigeni sono stati scelti sulla base di incoraggianti risultati clinici del nostro e di altri gruppi che mostrano che le cellule T diretta contro Adv-hexon e Penton 2,4-6, e di CMV-1E1 e per CMV pp65 sono protettivi in vivo 7. Per EBV, EBNA1 è un immunodominanti CD4 + antigene delle cellule T obiettivo espresso in tutte le neoplasie EBV-associati e in normali cellule infettate da EBV-B 8,9, LMP2 è immunogenico per tutti i tipi HLA più ed espresse nella maggior parte dei tumori EBV, 10,11 mentre BZLF1 codifica un immunodominanti, immediato antigene precoce ciclo litico che stimola sia CD4 + e CD8 + T dalla maggior parte degli individui ed è probabile che importante per la control di cellule replicazione del virus 12. Per ottimizzare ulteriormente i nostri metodi di produzione abbiamo collaborato con la tecnologia che la Natura ha generato minimizzato, antibiotico-free (FDA-compliant) plasmidi per la stimolazione CTL 13,14. Utilizzando questa strategia abbiamo sempre raggiungere efficienze nucleofection del> 35%, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule (dati non riportati) 3. La figura 2 mostra che la frequenza del virus-specifiche cellule T in risposta a plasmidi DNA ottimizzato come misurato da IFNγ ELISPOT, era maggiore che in risposta a pShuttle tradizionali a base di plasmidi di espressione che esprimono gli stessi antigeni (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV e EBV n = 2). Il rapporto ottimale tra DC: PBMC è stata importante per la potente stimolazione delle cellule T, come mostrato nella Figura 3, dove un rapporto di 1:50 prodotta sub-ottimali di attivazione rispetto a S 1:20 a: rapporto R (n = 2 donatori). Produzione di sufficiente numero di CTL con specificità antigenica ampio è un pre-requisito per l'efficacia clinica nei confronti di tutti e tre i virus. Questo risultato è ottenuto dalla cultura CTL nel G-Rex, che supporta l'espansione delle cellule T superiore rispetto ai tradizionali 24 pozzetti (Figura 4A) 15, mentre l'aggiunta di IL4 e IL7 ad aumenti delle culture del repertorio e la specificità come mostrato nella Figura 4B dove la frequenza di cellule T reattive contro il CMV pp65-derivati ​​HLA-A2 resticted NLV peptide è stata valutata nelle culture generate in presenza o assenza di IL4 e / o IL7 16,17. Per valutare la capacità fenotipo e funzionale delle cellule espanse che effettuare analisi citometria a flusso, intracellulare di citochine colorazione / IFNγ ELISPOT, e Cr 51 saggi di rilascio del prodotto finale per la crioconservazione / infusione. Tipicamente le cellule generate sono policlonali con una popolazione mista di cellule CD4 + e CD8 + T con l'antigene-specificità rilevabili in entrambi i comparti delle cellule T. Il CTL sono in grado di uccidere che esprimono l'antigene virale cellule bersaglio del virus, ma non negativo parzialmente HLA obiettivi abbinati, ad indicare che non devono indurre graft-versus-host disease (GvHD) in vivo (Figura 5). Figura 1. Protocollo generazione RCtl. In primo luogo, DC sono nucleofected con l'antigene virale codifica plasmidi e poi mescolato con PBMC autologo a R: S di 10 o 20:1. Le cellule vengono espanse nel G-Rex per 10-14 giorni in presenza di IL4 e IL7, poi raccolte, contate, testato per la funzione, l'identità e la sterilità, e poi crioconservati per uso clinico. Figura 2. Plasmidi DNA Ottimizzato indurre superiore attivazione delle cellule T in vitro. DC sono stati ottimizzati con nucleofected, FDA-compliant plasmidi codifica Hexon e Penton (Adv), IE1 e pp65 (CMV), e EBNA1, LMP2, e BZLF1 (EBV) o plasmidi pShuttle convenzionale codifica gli stessi antigeni. Questi sono stati utilizzati per stimolare le cellule T e la specificità è stata analizzata da ELISPOT IFNγ 10 giorni post-stimolazione. Figura 3 CC ottimale:. Ratio per l'attivazione delle cellule T CTL. DC da 2 donatori erano nucleofected con tutti e tre i plasmidi ottimizzato e poi utilizzati per stimolare PBMC autologhi a 1:20 o 1:50 DC: rapporto di PBMC. La frequenza di cellule T è stata valutata riattivato il giorno 10 da IFNγ ELISPOT. Figura 4. Espansione delle cellule T nel G-Rex con citochine migliorare. Un pannello mostra la G-Rex dispositivo, nonché l'aspetto CTL sulla membrana permeabile ai gas, valutata al microscopio. Un confronto tra la produzione delle cellule ottenuti in colture di tessuti trattati convenzione piatti vs G-Rex è anche mostrato. Pannello B mostra la frequenza del CTL CMV pentamero positivi ottenuti in colture espanse in presenza di nessuna delle citochine, IL4 solo, IL7 solo e IL4 + IL7. Figura 5. Fenotipo e la funzione del CTL ampliato. Panel A presenta un esempio rappresentativo del fenotipo del CTL ampliato multivirus, che sono policlonali con una miscela di CD4 + (45% – helper) e CD8 + (42% – citotossici) cellule T, di cui la maggioranza (95%) ha espresso il memoria marcatore CD45RO + / CD62L +. pannello B mostra che queste cellule sono specifici per tutti gli antigeni stimolante e sono polifunzionali come valutato dalla colorazione delle citochine intracellulari di rilevare la produzione di IFNΓ e TNFa dopo la stimolazione antigene. Panel C mostra che il CTL espanse sono funzionali misurate da Cr 51 test. Autologo LCL, da solo o trasdotte con un vettore nullo o un vettore adenovirale che esprime CMV pp65 sono state usate come catrameottiene. Alloreattività è stata valutata utilizzando allogenico esplosioni PHA come bersaglio.