דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

1. DC nucleofection מונוציטים הנגזרות קציר DCs, אשר היו מועשר באמצעות דבקות פלסטיק, בתרבית במשך 5 ימים באמצעות Cell Genix מדיה בתוספת IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) ו התבגר נוספת 24hrs באמצעות ציטוקינים התבגרות DC IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml ו PGE2 (1μg/ml) 1, על ידי resuspension עדין עם טפטפת העברת 3ml. הרוזן DCs קיימא באמצעות trypan כחול, העברה לתוך צינורות 15ml 3x עם לא פחות מ 0.5×10 6 ולא יותר מ 2×10 6 תאים / צינור. צנטריפוגה DCs עבור 10mins @ 200 גרם. במהלך הזמן הזה מראש חם Cell Genix התקשורת השלים עם ציטוקינים התבגרות DC (DC התקשורת התבגרות) – 2ml/well בשלוש בארות התרבות 12-באר רקמות שטופלו צלחת 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור. ברגע שסיימת תאים ספינינג, לשאוב supernatant ולהוסיף את פלסמידים DNA רלוונטי לכל אחד הצינורות בריכוז סופי של ה-DNA צינור 5μg /. במקרה זה להוסיף את הקידוד פלסמיד IE1-pp65 לצינור מס '1, Hexon-פנטון על צינור מס' 2, ו-EBNA1 LMP2-BZLF1 אל צינור # 3. Resuspend DCs ו-DNA עם 100μl של פתרון nucloefection Amaxa, מערבבים היטב ומעבירים את cuvettes nucleofection. Cuvettes מקום nucleofector 4D, לבחור תוכנית CB150 (Amaxa / Lonza), ולחץ להתחיל. מיד לאחר nucleofection להוסיף 500μl של 2ml מראש חימם Cell Genix DC התקשורת התבגרות כדי קובט, מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים, DCs nucleofected להעביר לצלחת 12 גם מוכן המכיל את הנותרים 1.5 מ"ל של prewarmed DC התקשורת התבגרות. העברה של 37 ° C / 5% CO 2 חממה נוספת 12-18hrs. 2. גירוי תא T קציר ולספור DCs nucleofected ו מקרינים על 30Gy. לשטוף פעם אחת עם 10 מ"ל של מדיום CTL (45% RPMI, קליקים EHAA 45%, 10% FBS, 2mm Glutamax) ו resuspend @ 3 x 10 5 DCs לכל מ"ל של התקשורת CTL. בריכת מינימום של 7.5×10 5 (2.5ml) ועד למקסימום של 15×10 5 (5 מ"ל) של DCs המכילות כל אחת פלסמידים ולהעביר את DCs נקווה למכשיר ה-G-Rex, אשר לאחר מכן ניתן יהיה להציב בחממה. להכנת תאים המגיב להשתמש גם PBMCs קפוא בעבר או לא חסיד mononuclear התאים שנותרו לאחר הבחירה DC ​​(או דבקות CD14 מבחר). להפשיר את התאים, להעביר בינוני תרבות prewarmed, לשטוף פעם עם התקשורת CTL. Resuspend התאים מדיה CTL, לספור את התאים ולהביא אותם בריכוז של 2×10 6 תאים לכל מיליליטר. קח 15×10 6 תאים או 7.5ml ולהשלים עם 30000U IL4 (1000U/ml -. קונצרט כלשהו סופי) ו 300ng IL7 (10ng/ml – קונצרט כלשהו הסופי.). העברת 7.5ml של PBMC (15×10 6 תאים) ל-G-רקס למעלה למעלה bioreactor עם התקשורת CTL כדי בהיקף כולל של 30 מ"ל. תרבות ה-G-Rex במשך 6-7 ימים 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור humidified. 3. T הרחבת התא ביום 6-7, 10 מ"ל לשאוב התקשורת, ואז לערבב את התאים הנותרים 20ml של התקשורת עם פיפטה 10 מ"ל ו לספור תאים קיימא באמצעות trypan כחול. אם יש <50×10 6 לחדש עם התקשורת + ציטוקינים טריים. אם יש> 50×10 6 תאים להסיר 10ml ההשעיה התא, העברה חדשה G-Rex, ולאחר מכן להאכיל גם G-Rexs עם התקשורת CTL + ציטוקינים טריים. התרבות 4-6 ימים נוספים. לאחר מספיק תאים הורחבו, לבצע אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של עודף CTL ו cryopreserve לשימוש עתידי. 4. נציג תוצאות: סכמטי של תהליך ה-FDA multivirus הספציפי שלנו דור CTL מוצג באיור 1. בניגוד לאמנה פרוטוקולים multivirus CTL אשר השימוש adenovectors EBV ו-LCL לעורר וירוס-reactive בתאי T 2 יש לנו להחליף חומר וירוס מדבק עם פלסמידים DNA המקודדים אנטיגנים רבים שמקורם בכל אחת וירוסים 3. כדי לעורר CTL trivirus עיצבנו three multicistronic פלסמידים קידוד Hexon ו פנטון של adenovirus, IE1 ו pp65 של CMV, ו EBNA1, LMP2 ו BZLF1 של EBV. אנטיגנים אלה נבחרו בהתבסס על תוצאות מעודדות הקליניים של שלנו ושל קבוצות אחרות מראים כי תאי T המכוונים נגד עו"ד hexon ו-פנטון 2,4-6, וכדי CMV-1E1 ו CMV-pp65 הם המגן in vivo 7. עבור EBV, EBNA1 היא מסוג CD4 + immunodominant היעד תא T אנטיגן לידי ביטוי בכל EBV הקשורים ממאירות וכן EBV נגועים בתאים נורמליים B 8,9, LMP2 הוא immunogenic בין סוגי HLA מרובים לידי ביטוי ממאירות EBV ביותר, בעוד 10,11 BZLF1 מקודד immunodominant, אנטיגן מיידית מוקדם במחזור ממס מגרה הן מסוג CD4 + ו – CD8 + T תאים מרוב יחידים חשוב סביר לדוntrol של תאים שכפול הנגיף 12. כדי להמשיך לייעל את שיטות הייצור שלנו אנו פעולה עם טכנולוגיה הטבע שיצר minimalized, ללא אנטיביוטיקה (FDA תואמי) פלסמידים לגירוי CTL 13,14. באמצעות אסטרטגיה זו אנו בעקביות להשיג יעילות של 35% nucleofection> תוך שמירה על כדאיות התא גבוה (מידע לא מוצג) 3. איור 2 מראה כי שכיחותה של וירוס ספציפי בתאי T בתגובה פלסמידים DNA אופטימיזציה כפי שנמדד על ידי IFNγ ELIspot, היה גדול יותר מ בתגובה pShuttle מבוססי פלסמידים קונבנציונאלי ביטוי המבטא את אנטיגנים זהה (n = 8 adenovirus, n = 4 CMV, ו n = 2 EBV). יחס אופטימלי של DC: PBMC היה חשוב גירוי חזק תא T כפי שמוצג באיור 3 שם יחס של 1:50 המיוצר תת אופטימלית ההפעלה לעומת 1:20 S: יחס R (n = 2 תורמים). הפקה של מספרים CTL מספיק עם סגוליות אנטיגן רחב הוא תנאי מוקדם עבור יעילות קלינית כנגד כל שלושת וירוסים. זו מושגת על ידי תרבות CTL ב-G-Rex, התומך תא מעולה הרחבה T לעומת 24 גם צלחות קונבנציונאלי (איור 4 א) 15, תוך תוספת של IL4 ו IL7 לעליות תרבויות הרפרטואר וספציפיות כפי שמוצג באיור 4B איפה את תדירות בתאי T תגובתי נגד CMV-pp65-derived HLA-A2 resticted NLV פפטיד הוערך בתרבויות שנוצר נוכחות או היעדר של IL4 ו / או IL7 16,17. כדי להעריך את היכולת פנוטיפ תפקודית של תאים מורחבת אנו מבצעים ניתוח תזרים cytometric, תאיים מכתים / IFNγ ציטוקינים ELIspot, Cr ו – 51 מבחני שחרור על המוצר הסופי עבור cryopreservation / חליטה. בדרך כלל התאים שנוצרו הם polyclonal עם אוכלוסייה מעורבת של CD4 + ו – CD8 + T תאים עם סגוליות-אנטיגן להבחין בשני תאים תא T. CTL מסוגלים להרוג אנטיגן נגיפי לבטא בתאי המטרה, אך לא וירוס שלילית חלקית HLA יעדים מתאימים, המציין כי הם לא צריכים לגרום השתל נגד מארח מחלה (GVHD) in vivo (איור 5). באיור 1. בפרוטוקול rCTL ​​דור. ראשית, הם DCs nucleofected עם אנטיגן קידוד פלסמידים ויראלי ולאחר מכן מעורבב עם PBMCs עצמיים ב-R: S של 10 או 20:01. תאים הם התרחבו ב-G-Rex במשך 10-14 ימים בנוכחות IL4 ו IL7, שנקטפו אז, נספר, נבדק על זהות פונקציה, עקרות, וגם אז cryopreserved לשימוש קליני. איור 2. פלסמידים DNA אופטימליים לגרום לתא מעולה הפעלה T במבחנה. DCs היו nucleofected עם אופטימיזציה, ה-FDA תואמי פלסמידים קידוד Hexon ו פנטון (עו"ד), ו IE1 pp65 (CMV), ו EBNA1, LMP2 ו BZLF1 (EBV) או פלסמידים pShuttle קונבנציונאלי קידוד אנטיגנים אותו. אלה שימשו כדי לעורר בתאי T וספציפיות נותח על ידי ELIspot IFNγ 10 ימים לאחר גירוי. איור 3 DC אופטימלית:. יחס תא T להפעלת CTL. DCs מ 2 התורמים היו nucleofected עם כל שלושת פלסמידים מותאם ולאחר מכן השתמשו כדי לעורר PBMCs עצמיים בשעה 1:20 או 1:50 DC: יחס PBMC. תדירות של תאים T מחדש הוערכה על 10 יום על ידי IFNγ ELIspot. איור 4. התרחבות T תא ה-G-Rex באמצעות ציטוקינים שיפור. לוח מראה את מכשיר ה-G-רקס, כמו גם המראה CTL על קרום חדיר גז, מוערך על ידי מיקרוסקופית. השוואה בין התפוקה תא להשיג בתרבית רקמה כנס מטופלים צלחות vs G-Rex מוצג גם. לוח ב 'מראה את התדר של CTL pentamer CMV חיובית מושגת בתרבויות מורחב בנוכחות ציטוקינים לא, IL4 לבד, לבד IL7 IL4 + IL7. איור 5. הפנוטיפ והתפקוד של CTL מורחבת. לוח מראה דוגמה מייצגת של הפנוטיפ של CTL multivirus מורחבת, אשר polyclonal בתערובת של CD4 + (45% – עוזר) ו – CD8 + (42% – ציטוטוקסיות) ותאי T, אשר רובם (95%) הביעו את זיכרון סמן CD45RO + / CD62L +. לוח ב 'מראה כי תאים אלה הם ספציפיים לכל האנטיגנים מגרה והם polyfunctional כפי שהוערכו על ידי מכתים ציטוקינים תאיים לאתר הייצור של IFNΓ ו TNFα לאחר גירוי אנטיגן. לוח C מראה כי CTL מורחבת הם פונקציונליים, כפי שהיא נמדדת על ידי assay 51 Cr. LCL עצמיים, לבד או עם transduced וקטור ריק או וקטור adenoviral להביע CMV-pp65 שימשו זפתמקבל. Alloreactivity הוערכה באמצעות allogeneic תקיעות PHA כמטרה.