Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

1. DC nucleofection Oogst monocyt-afgeleide DC's, die zijn verrijkt met behulp van plastic hechting, gekweekt voor 5 dagen met behulp van Cell Genix Media aangevuld met IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) en verder gerijpt voor 24 uur gebruik van de DC rijping cytokines IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml en PGE2 (1μg/ml) 1, door de zachte resuspensie met een 3 ml transferpipet. Count levensvatbare DC's met behulp van trypan blauw, transfer naar 3x 15ml buizen met niet minder dan 0.5×10 6 en niet meer dan 2×10 6 cellen / buis. Centrifuge DC's voor 10 minuten @ 200g. Gedurende deze tijd pre-warm Cell Genix media aangevuld met de DC rijping cytokines (DC rijping media) – 2ml/well in drie putjes van een 12-well weefselkweek behandeld plaat in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator. Zodra cellen klaar bent met spinnen, aspireren het supernatans en voeg de desbetreffende DNA-plasmiden aan elk van de buizen in een uiteindelijke concentratie van 5μg DNA / buis. In dit geval voegt u de plasmide coderend voor IE1-pp65 om buis # 1, Hexon-Penton tube naar # 2, en EBNA1-LMP2-BZLF1 van de buis # 3. Resuspendeer DCs en DNA met 100μl van Amaxa nucloefection oplossing, goed mengen en over te dragen aan de nucleofection cuvetten. Plaats cuvetten in de 4D nucleofector, kiest u het programma CB150 (Amaxa / Lonza), en druk op start. Direct na het nucleofection toe te voegen 500μl van de 2 ml voorverwarmd Cell Genix DC rijping media om de cuvet, meng voorzichtig door en neer te pipetteren 2-3 keer, en overdracht nucleofected DC's naar de voorbereide 12-wells plaat met de resterende 1,5 ml voorverwarmd DC rijping media. Transfer naar de 37 ° C / 5% CO 2 incubator voor een verdere 12-18u. 2. T-cel stimulatie Oogst en tellen nucleofected DC's, en stralen bij 30Gy. Was eenmaal met 10 ml van de CTL medium (45% RPMI, 45% Clicks EHAA, 10% FBS, 2mm Glutamax) en resuspendeer @ 3 x 10 5 DC's per ml van de CTL media. Pool een minimum van 7.5×10 5 (2,5 ml) en een maximum van 15×10 5 (5 ml) van DCs met elk van de plasmiden en de overdracht van de gepoolde DC's naar de G-Rex apparaat die vervolgens zal worden geplaatst in de incubator. Voor de voorbereiding van de reagerende cellen gebruiken ofwel voorheen bevroren PBMCs of niet-adherente mononucleaire cellen die achterblijven na de DC-selectie (de naleving of CD14 selectie). Ontdooi de cellen, transfer naar voorverwarmde kweekmedium, een keer wassen met CTL media. Resuspendeer de cellen in CTL Media, de telling van de cellen en breng ze naar een concentratie van 2×10 6 cellen per ml. Neem 15×10 6 cellen of 7.5ml en te vullen met 30000U IL4 (1000U/ml -. Finale conc) en 300ng IL7 (10ng/ml – finale conc.). Overdracht 7.5ml van PBMC (15×10 6 cellen) van de G-Rex en vul de bioreactor met CTL media om een totaal volume van 30 ml. Cultuur van de G-Rex voor 6-7 dagen in een 37 ° C / 5% CO 2 bevochtigde incubator. 3. T-cel expansie Op dag 6-7, aspiratie 10 ml van de media, en meng de cellen in de resterende 20 ml van de media met een 10 ml pipet en tel levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw. Als er <50×10 6 aan te vullen met verse media + cytokines. Als er> 50×10 6 cellen te verwijderen 10 ml celsuspensie, over te dragen aan een nieuwe G-Rex, en dan voeden zowel de G-Rexs met verse CTL media + cytokines. Cultuur voor een extra 4-6 dagen. Als er voldoende cellen zijn uitgebreid, voert fenotypische en functionele karakterisatie van het CTL en cryopreserve eigen risico voor toekomstig gebruik. 4. Representatieve resultaten: Een schema van onze FDA-goedgekeurde multivirus-specifieke CTL generatie proces is weergegeven in figuur 1. In tegenstelling tot de conventie multivirus CTL protocollen die adenovectors en EBV-LCL te gebruiken om virus-reactieve T-cellen te stimuleren 2 hebben we infectieus virus materiaal vervangen door DNA plasmiden die coderen voor meerdere antigenen afgeleid van elk van de virussen 3. Het stimuleren van trivirus CTL ontwierpen we drie multicistronic plasmiden die coderen voor Hexon en Penton van adenovirus, IE1 en pp65 van CMV, en EBNA1, LMP2, en BZLF1 van EBV. Deze antigenen zijn gekozen op basis van bemoedigende klinische resultaten van onze eigen en andere groepen waaruit blijkt dat T-cellen gericht tegen Adv-Hexon en Penton 2,4-6, en om CMV-1E1 en om CMV-pp65 beschermend zijn in vivo 7. Voor EBV, EBNA1 is een immunodominant CD4 + T-cel doelantigeen uitgedrukt in alle EBV-geassocieerde maligniteiten en in normale EBV-geïnfecteerde B-cellen 8,9, LMP2-immunogeen is over meerdere HLA-typen en uitgedrukt in de meeste EBV maligniteiten, 10,11 terwijl de BZLF1 codeert voor een immunodominant, directe vroege lytische cyclus antigen dat zowel CD4 + en CD8 + T-cellen stimuleert van de meeste particulieren en is waarschijnlijk van belang voor de samenwerkingntrol van cellen vermenigvuldigend virus 12. Verder te optimaliseren onze productie-methoden die we samen met de Natuur-technologie, die geminimaliseerd, antibiotica-vrij (FDA-compatibel) plasmiden gegenereerd voor CTL stimulatie 13,14. Met behulp van deze strategie die we consequent te bereiken nucleofection efficiëntie van> 35% met behoud van hoge levensvatbaarheid van de cellen (gegevens niet getoond) 3. Figuur 2 blijkt dat de frequentie van de virus-specifieke T-cellen in reactie op geoptimaliseerde DNA plasmiden zoals gemeten door IFNy ELISPOT, was groter dan in de respons op de conventionele pShuttle-based expressieplasmiden de uiting van de dezelfde antigenen (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV, en n = 2 EBV). De optimale verhouding tussen DC: PBMC was belangrijk voor sterke T-cel stimulatie zoals weergegeven in figuur 3, waar een verhouding van 1:50 sub-optimale activatie geproduceerd in vergelijking met een 01:20 S: R-verhouding (n = 2 donoren). Productie van voldoende CTL nummers met een brede antigen specificiteit is een eerste vereiste voor klinische werkzaamheid tegen alle drie virussen. Dit wordt bereikt door CTL cultuur in de G-Rex, die een superieure T-cel expansie ondersteunt in vergelijking met conventionele platen met 24 putjes (Figuur 4A) 15, terwijl de toevoeging van IL4 en IL7 om culturen verhoogt het repertoire en specificiteit voldoen als weergegeven in figuur 4B waar de frequentie van de T-cellen reactief tegen het CMV-pp65-afgeleide HLA-A2 resticted NLV peptide werd beoordeeld in culturen gegenereerd in de aanwezigheid of afwezigheid van IL4 en / of IL7 16,17. Voor de beoordeling van het fenotype en functionele capaciteit van de geëxpandeerde cellen voeren we flowcytometrische analyse, intracellulaire cytokine kleuring / IFNy ELISPOT, en Cr 51 release assays op het uiteindelijke product voor cryopreservatie / infusie. Typisch de gegenereerde cellen polyklonaal met een gemengde bevolking van CD4 + en CD8 + T-cellen met antigeen-specificiteit aantoonbaar in zowel de T-cel compartimenten. De CTL zijn in staat om virale antigeen tot expressie brengen target cellen te doden, maar niet het virus negatieve gedeeltelijk HLA gematchte targets, wat aangeeft dat zij niet graft-versus-host disease (GvHD) te induceren in vivo (figuur 5). Figuur 1. RCTL generatie protocol. Eerst worden DCs nucleofected met het virale antigeen-encoding plasmiden en vervolgens gemengd met autologe PBMC's op een R: S van 10 of 20:1. Cellen zijn uitgebreid in de G-Rex voor 10-14 dagen in de aanwezigheid van IL4 en IL7, vervolgens geoogst, geteld, getest voor de functie, identiteit en steriliteit, en dan gecryopreserveerd voor klinisch gebruik. Figuur 2. Optimized DNA plasmiden induceren superieure T-cel activatie in vitro. DC werden nucleofected met geoptimaliseerde, FDA-compliant plasmiden die coderen voor Hexon en Penton (ADV), IE1 en pp65 (CMV), en EBNA1, LMP2, en BZLF1 (EBV) of conventionele pShuttle plasmiden die coderen voor de dezelfde antigenen. Deze werden gebruikt om de T-cellen te stimuleren en de specificiteit werd geanalyseerd door IFNy ELISPOT 10 dagen na de stimulatie. Figuur 3 Optimale DC:. T-cel-ratio's voor CTL activatie. DC's van twee donoren nucleofected met alle drie de geoptimaliseerde plasmiden en vervolgens gebruikt om autologe PBMC's te stimuleren op 1:20 of 1:50 DC: PBMC verhouding. De frequentie van gereactiveerd T-cellen werd bepaald op dag 10 door IFNy ELISPOT. Figuur 4. T-cel expansie in de G-Rex met behulp van de verbetering cytokines. Panel A geeft de G-Rex apparaat als CTL verschijning op de gas-permeabel membraan, geëvalueerd door microscopie. Een vergelijking tussen de cel-uitgang bereikt in conventie weefselkweek behandeld platen vs G-Rex is ook getoond. Panel B geeft de frequentie van CMV pentameer positieve CTL bereikt in culturen uitgebreid in de aanwezigheid van geen cytokine, IL4 alleen, IL7 alleen en IL4 + IL7. Figuur 5. Fenotype en functie van de uitgebreide CTL. Paneel A toont een representatief voorbeeld van het fenotype van de uitgebreide multivirus CTL, die polyklonale met een mengsel van CD4 + (45% – helper) en CD8 + (42% – cytotoxische) T-cellen, waarvan de meerderheid (95%) zich op het geheugen marker CD45RO + / CD62L +. Panel B geeft aan dat deze cellen specifiek zijn voor alle stimulerende antigenen en worden polyfunctioneel zoals beoordeeld door intracellulaire cytokine kleuring om de productie van IFNy en TNFa na antigen stimulatie op te sporen. Paneel C toont aan dat de uitgebreide CTL zijn functioneel, zoals gemeten door Cr 51-test. Autologe LCL, hetzij alleen of getransduceerd met een nul-vector of een adenovirale vector die CMV-pp65 werden gebruikt als teerkrijgt. Alloreactiviteit werd gemeten met behulp van allogene PHA ontploffing als een doel.