Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie
Summary
Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.
Abstract
Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.
Protocol
Discussion
Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
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