Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux
Summary
Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l'exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.
Abstract
Les cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques pulmonaires (PMA) en continu de l'échantillon les antigènes des espaces alvéolaires dans les poumons. PMA, en particulier, sont connus pour migrer vers les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) où ils présentent les antigènes aux cellules T inhalé initier une réponse immunitaire appropriée à une variété d'immunogènes 1,2. Pour le modèle des interactions entre les poumons et les antigènes en suspension dans les souris, les antigènes peuvent être administrés par voie intranasale 1,3,4, intratrachéale 5 ou 6 sous forme d'aérosols. Livraison par chaque itinéraire implique distinctes des compétences techniques et des limitations qui doivent être considérés avant de concevoir une expérience. Par exemple, l'exposition intranasale et sous forme d'aérosol fournit des antigènes à la fois dans les poumons et les voies respiratoires supérieures. Ainsi antigènes peuvent accéder le tissu lymphoïde associé nasales (NALT) 7, potentiellement compliquer l'interprétation des résultats. En outre, la déglutition, l'éternuement et la fréquence respiratoire de la souris peut aussi conduire à des incohérences dans les doses délivrées. Bien que l'implication des voies respiratoires supérieures peut être préférable pour certaines études, cela peut compliquer les expériences portant sur des événements spécifiquement initiée dans les poumons. Dans ce cadre, le intratrachéale (it) la route est préférable car elle offre le matériel de test directement dans les poumons et contourne le NALT. De nombreux protocoles d'injection l'impliquer intubation soit aveugles de la trachée à travers la cavité buccale ou de l'exposition chirurgicale de la trachée d'accéder à des poumons. Nous décrivons ici un simple, cohérente et non-chirurgical méthode pour qu'il l'instillation. L'ouverture de la trachée est visualisée à l'aide d'un laryngoscope et une aiguille tordue gavage est ensuite inséré directement dans la trachée pour livrer l'inoculum. Nous avons également décrire les procédures de récolte et de transformation des LDLNs et des poumons pour l'analyse du trafic de l'antigène par cytométrie en flux.
Protocol
Discussion
Nous avons utilisé ce protocole pour étudier le trafic de spores de Bacillus anthracis à partir des poumons vers le LDLNs. Pour des applications similaires, le nombre de particules délivré aux poumons doivent être soigneusement choisis de sorte que le matériau injecté peut être détecté dans le LDLNs par cytométrie en flux. Nous avons également utilisé avec succès cette méthode pour le transfert adoptif de cellules et d'étiquetage des populations spécifiques de cellules pulmonaires en utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
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