Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

1. Omurilik dokusunda Fototerapisi Spinal kord segmentleri yaralı olmayan yaralı ya da spinal kord kontüzyonu T8-T10 (T9 az yaralanma) Sprague Dawley rat disseke ve oda sıcaklığında HBSS ince makas mekanik olarak ayrışmış, önceden 1 tarif. Doku disosiasyon öncesinde, bütün omurilik sütunları kord segmentleri T8-T10 ekstraksiyon önce 5 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutuldu. Doku bit santrifüj (1 dakika, 1000 rpm, oda sıcaklığında) ve 2.5 mg tripsin ve 20 dakika boyunca 37 az 5 ml DME (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı medya) 5 mg kollajenaz ° öğütme önce C (enzimatik ayrışmış tarafından alınan edildi ~ 10 kez oda sıcaklığında) bir cam Pasteur pipeti (9-inç). DME +% 10 fetal sığır serumu 10 ml enzim faaliyetlerinin engellenmesi ve ardından 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür hücrelere eklendi. Hızlı bir spin sonra, hücre pelletini HBSS 6 ml yeniden süspanse edildi ve OptiPrep degrade çözümleri aşağıda açıklanan üzerine yerleştirilmiştir. 2. OptiPrep degrade çözümler oluşturma Seyreltilmiş OptiPrep OptiPrep 01:01 MOPS Buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS pH 7.4) ile seyreltilmesi ile inşa edilmiştir. Dört OptiPrep degrade çözümleri karıştırma 350, 250, 200 veya 150 ul seyreltilmiş OptiPrep son hacmi 1 ml (Tablo 1) HBSS tarafından yapılmıştır. Dört çözüm yavaş ve dikkatli altındaki en seyreltik ve en üst (Şekil 1A) seyreltilmiş bir 15 ml konik tüp katmanları yerleştirildi. 3. Hücrelerin lipid / miyelin enkaz ayırmak 6 ml HBSS ayrışmış spinal hücrelerinin OptiPrep degrade çözümleri üstüne dikkatlice katmanlı oldu. Tüp içeren hücreler ve degrade çözümler lipid farklı katmanları içine hücre çözümü ayıran bir salıncak kova rotor (A-4-62) ile bir Eppendorf Centrifuge 5810R kullanarak santrifüj edildi (1900 rpm veya 726 RCF, 15 dakika, 20 ° C) / pelet inflamatuar hücreler, glia, ve kırmızı kan hücreleri nöronların 3 kat, takip miyelin enkaz (üst 7 ml tüp). Bazı büyük ölçekli aktive makrofajlar, monositler, makrofajlar, PMN granülositler ve lenfositler de dahil olmak üzere pek çok inflamatuvar hücreler, pelet bulundu rağmen, pelet yukarıda katmanlar halinde tespit edilemedi. Lipid / miyelin enkaz tabakası (üst 7 ml) aspire kaldırıldı. Hücreler daha sonra yıkanır ve 2.5 ml HBSS yeniden bekletildi ve aşağıda immunolabeling için kullanılır. 4. Flow sitometri için spesifik bağışıklık hücrelerinin Immunolabeling Omurilik hazırlıkları toplanan Hücreler (500 ul) pelet ve kırmızı kan hücreleri lyse için 5 dakika için 0.85% amonyum klorür (distile su ile seyreltilmiş) yeniden süspanse. Hücreler 500 ul HBSS ile yıkanmalı ve daha sonra, oda sıcaklığında, normal tavşan ya da fare serumu 30 dakika süreyle bloke edildi. Ya da sulandırılmış izotip IgG çözüm Hücreler 1 antikoru ile saat (; Fare anti-sıçan ED1 Alexa 488, Serotec veya Fare anti-sıçan CD3 Alexa 488 Tavşan anti-PMN FITC, Doğru Kimyasal ve Bilimsel) yıkanmış ve oda sıcaklığında inkübe HBSS (1:100 dilüsyon), daha önce 1 nitelendirdi. Hücreler 300 ul HBSS son adım sonra yeniden süspanse her adımdan sonra yukarıda ve daha sonra iki kez yıkandı. 5. Flow sitometri ile hücre nicel değerlendirmesi Hücre Görev yazılımı kullanarak bir FACS Calibur (Becton-Dickinson) akış sitometresinin Numuneler analiz edildi. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve veri analizi Zirvesi (DakoCytomation) ile tamamlanmıştır. Flow sitometrik kapıları,, daha önce 1 açıklandığı gibi zaman noktaları arasında normalleşme için temel değerlerini ayarlamak için kontrol IgG izotip etiketli hücreleri veya yaralanmamış bir şekilde kontrol hayvanlardan omurilik hücreleri kullanılarak ayarlanır . Olumlu etiketli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi. 6. Temsilcisi Sonuçlar: 1 spinal PMN niceleme miyelin enkaz kaldırmak ve flow sitometri ile immün hücre algılama geliştirmek için bir OptiPrep degrade yeteneği değerlendirildi dpi (Şekil 1B), SKY 1-3 sonra PMN infiltrasyonu önceden bildirilen tepe. Alternatif olarak, aynı disseke omurilik miyelin enkaz OptiPrep çıkarmadan enzimatik ayrışmış ve benzer flow sitometri ile PMN infiltrasyonu paralel olarak değerlendirildi. Biz daha önce 1 bildirdin gibi, sağlam miyelin enkaz örneklerinde tespit PMNs'nin yüzdesini gösteren, sadece bir kısmını (% 0.5) tek başına enzimatik disosiasyon göre OptiPrep degrade arıtma yöntemi ile izole edilen örneklerde olayların konumunda bir değişim var . OptiPrep purif tespit PMNs'nin yüzdesi (% 5.1)IED örnekleri (Şekil 1B). Bu veriler doku hazırlıkları miyelin enkaz akım sitometrik okuma belirsiz olduğunu göstermektedir ve bu miyelin enkaz kaldırma yaralı omurilik dokusunda immün hücre algılama hassasiyeti artırır göstermek. Yaralı omurilik hücre tespiti için OptiPrep degrade sisteminin hassasiyeti tespit ettikten sonra, 2 saat ile 180 dpi arasında değişen bir süre içinde hücresel infiltrasyon değişiklikler karakterize ve PMN, makrofajlar dahil SKY sonra hücresel inflamasyon bir roman multifazik yanıt kurdu / mikroglia ve T-hücrelerinin. 1-3 önceki çalışmalar tarafından onaylandıktan sonra, PMN-yaralanma sonrası ilk 2 saat kablosu girdi ve 1 dpi (Şekil 2 & 4) zirve yaptı. Öte yandan 1,4,5 Makrofajlar / mikroglia 3 dpi kadar yaralı spinal kord tespit ve başlangıçta 7 dpi (Şekil 3 ve 4) zirve yaptı değildi. Hayret, biz ilk defa makrofaj / mikroglia doruğa için ikinci kez 60 dpi ve 180 dpi (Şekil 3 ve 4) ile yüksek kaldı göstermektedir. Makrofaj / mikroglia, benzer şekilde T-hücre infiltrasyonu 7 dpi 5-7 zirve tahmin; ancak, flow sitometri, ilk 7 dpi yüksek bir T-hücrelerinin sayısı tespit edildi rağmen, T hücre sayısında herhangi bir değişiklik tespit etmedi 9 dpi (% 1.6) (Şekil 4). T-hücre sayısı 10 dpi, hücrelerin% 4.4 CD3 (Şekil 4) etiketli hangi zaman kalıcı bir T-hücre yanıtı, 180 dpi aracılığıyla gözlendi azalarak iken. Birlikte, bu veriler SKY sonrasında hücresel inflamasyon (Şekil 4) bir zamana bağımlı multifazik tepki göstermek; hücresel inflamasyon ilk aşamalarında dpi ED1, bir tepe + makrofaj / mikroglia 7 dpi ve T tarafından takip PMN 1 erken tepe oluşan edildi hücreleri 9 dpi, daha sonraki aşamalarında, 60 dpi çözünürlükte makrofaj / mikroglia kayda değer bir ikinci zirve, 14 dpi sonra yükselen ve 180 dpi ile ısrar üç hücresel nüfus, oluşmuştu. Bu timecourse flow sitometri tarafından oluşturulan çalışma ve nicel veri immunolabeled omurilik bölüm 1 kantitatif stereology toplanan veriler karşılaştırılabilir sonuçlar gösteren, daha önce onaylandı. Tablo 1. Miyelin enkaz kaldırma OptiPrep degrade hazırlanması Dört OptiPrep degrade çözümleri HBSS ve seyreltilmiş OptiPrep (OptiPrep ve MOPS 1:1 dilüsyon) kullanılarak yapılır. Şekil 1 OptiPrep degrade yoğunlukları ayrı çoğu miyelin / yaralı spinal kord dokuların / hücrelerin flow sitometri ile enkaz ve immün hücre değerlendirmesi geliştirmek. (A) Miyelin / enkaz miyelin / enkaz tabakası aspirasyonu ile takip OptiPrep degrade ile santrifüj sonra ayrışmış omurilik dokusu hücreleri (nöronlar, glia ve bağışıklık hücreleri) ayrıldı. (B) omurilik yaralı PMN numarası, enkaz kaldırma sonra PMN tespit artmış duyarlılık gösteren (Student t-testi, p = 0.0001). N = 5, grup başına ortalama ± SEM, tüm akım sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanılarak belirlenmiştir. Örnek başına 5.000 etkinlik örnekleri için okuma ve pozitif işaretli hücrelerin ortalama değerleri tüm örneklem yüzde (± SEM) olarak ifade edildi. Şekil 2 akış sitometri yaralanan omurilikte PMN infiltrasyonu Algılama. T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma sonrası, PMN hızlı başlayan ve 2 saat (B) post-yaralanma 1 dpi (C) zirve omurilik girdi. Bütün akış sitometrik kapıları yaralanmamış bir şekilde hayvanlar etiketli hücreleri (A) kullanılarak belirlendi. Şekil 3 flow sitometri yaralı omurilikte makrofaj / mikroglia infiltrasyon tespiti. T9 az bir orta (200 kd) kontüzyon yaralanma sonra ED1 + makrofaj / mikroglia sayısını 3 dpi (D) başlayan, yaralı spinal kord artan 7 dpi (E) akut zirve yaptı, 14 dpi (F) düşük seviyelere gerilemiştir , daha önce ikinci bir 60 dpi (G) zirvesine yükselen ve 180 dpi (H) omurilik yaralı kaldı. 7 dpi spinal hücrelerinin IgG izotip kontrol etiketleme (B) minimal antikor etiketleme arka plan ve 2 saat antikor etiketli hücreleri sonrası yaralı (C) veya yaralanmamış bir şekilde (A) hayvanlar için hiçbir fark gösterdi. Bütün akış sitometrik kapıları, yaralanmamış bir şekilde hayvanlardan etiketli hücreleri kullanarak kuruldu. Tablo 2. Timecourse deneyler Hayvan örnekleri her zaman noktası (0 saat 180 dpi), beş hayvan, T9 (200 kd) ılımlı bir kontüzyon yaralanma aldıve omurilik dokularında PMN, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 + T hücreleri numaraları için flow sitometri ile değerlendirildi. Ancak, tüm hayvan örnekleri PMN (4-5), ED1 (3-5) ve CD3 (4-5) akış sitometri analizleri için başarıyla kurtarıldı. Şekil 4 T9 ılımlı (200 kd) kontüzyon yaralanma omurilik hücresel inflamasyon timecourse. + T-hücrelerinin flow sitometri, PMNs'nin numaraları, ED1 + makrofaj / mikroglia ve CD3 tarafından değerlendirilir gibi akut zirve yaptı (sırasıyla 1,7 ve 9 dpi) ve kronik omurilik yaralı ısrar n = 3 ila 5 ortalama grubu, ortalama ± SEM.