Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

1. Dissociação do tecido da medula espinhal Segmentos da medula espinhal T8-T10 de não acidentados ou da medula espinhal feridos contusão (lesão no T9) ratos Sprague Dawley foram dissecados e mecanicamente dissociada com uma tesoura bem em HBSS à temperatura ambiente, como descrito anteriormente 1. Antes de tecido dissociação, toda colunas medula espinhal foram mantidos em gelo seco por 5 minutos antes da extração de segmentos de cabo de T8-T10. Pedaços de tecido foram recuperadas por centrifugação (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociado com 2,5 mg de tripsina e 5 colagenase mg em 5 ml DME (Media Modified Dulbecco Eagle) por 20 minutos a 37 ° C antes de trituração (~ 10 vezes à temperatura ambiente) com uma pipeta Pasteur de vidro (9 polegadas). 10 ml de DME + 10% de soro fetal bovino foi adicionado às células para inibir a atividade enzimática e, em seguida, foi filtrada através de um filtro de células 40 mM. Depois de um giro rápido, o pellet celular foi ressuspendido em 6 ml de HBSS e sobrepostos em soluções OptiPrep gradiente descrito abaixo. 2. Criando OptiPrep gradiente soluções OptiPrep diluída foi construída diluindo OptiPrep 1:1 com MOPS Tampão (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4). Quatro soluções OptiPrep gradiente foram feitos através da mistura de 350, 250, 200, ou 150 mL OptiPrep diluído com HBSS a um volume final de 1 ml (Tabela 1). As quatro soluções foram lenta e cuidadosamente colocados em camadas em um tubo de 15 ml cônico com menos diluída na parte inferior e mais diluída no topo (Figura 1A). 3. Separar lipídicas / mielina restos de células 6 ml de células dissociadas espinhal em HBSS foi cuidadosamente em camadas em cima das soluções gradiente OptiPrep. Tubo contendo células e soluções gradiente foi centrifugado (15 minutos, 1900 rpm ou 726 RCF, 20 ° C), utilizando uma centrífuga Eppendorf 5810R com um rotor basculante (A-4-62), separando a solução de células em camadas distintas com lipídios / mielina detritos (top 7 ml do tubo), seguido por três camadas de neurônios, com células inflamatórias, células gliais, e os glóbulos vermelhos no pellet. Embora a maioria das células inflamatórias, como monócitos, macrófagos, granulócitos PMN e linfócitos foram encontrados no sedimento, algumas de grande porte macrófagos ativados podem ser encontradas em camadas acima do sedimento. A camada de detritos lipídicas / mielina (top 7 ml) foi cuidadosamente aspirado e removido. As células foram então lavadas e ressuspendidas em 2,5 ml HBSS e usado para imunomarcação abaixo. 4. Imunomarcação de células imunes específicas para citometria de fluxo Células (500 mL) coletados de preparações da medula espinhal foram peletizadas e ressuspendidas em solução de cloreto de amônio 0,85% (diluído em água destilada) por 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue. Células foram lavadas com 500 mL HBSS e depois bloqueado por 30 minutos em coelhos normais ou soro do mouse em temperatura ambiente. Células foram lavadas e incubadas em temperatura ambiente por uma hora com o anticorpo (Rabbit anti-PMN FITC, Chemical precisa e científica; Rato anti-rato ED1 Alexa 488, Serotec, ou rato de rato anti-CD3 Alexa 488) ou solução isotipo IgG diluído em HBSS (todos na diluição 1:100), como descrito anteriormente 1. Células foram lavadas duas vezes depois de cada passo acima e então ressuspendido em 300 mL HBSS após a etapa final. 5. Avaliação quantitativa de células por citometria de fluxo As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton-Dickinson), utilizando software da Quest Cell. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e análise de dados foi concluída com a Summit (DakoCytomation). Portões de citometria de fluxo foram definidos usando células controle isotipo IgG rotulados ou células da medula espinhal de animais controle ileso para definir valores de referência para a normalização em momentos como descrito anteriormente 1. Os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra. 6. Resultados representativos: A capacidade de um gradiente OptiPrep para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células imunes por citometria de fluxo foi avaliada através da quantificação PMNs espinhal em 1 dpi (Figura 1B), o pico anteriormente relatados de infiltração PMN após SCI 1-3. Alternativamente, identicamente dissecados medulas espinhais foram enzimaticamente dissociado sem OptiPrep remoção de detritos de mielina e foram igualmente avaliados em paralelo para a infiltração PMN por citometria de fluxo. Como já relatado anteriormente 1, houve uma mudança na posição de eventos em amostras isoladas com OptiPrep método de purificação em relação ao gradiente de dissociação enzimática sozinho, demonstrando o percentual de PMNs detectados em amostras com resíduos de mielina intacta era apenas uma fração (0,5%) do percentual de PMN detectado (5,1%) em OptiPrep Purified amostras (Figura 1B). Estes dados sugerem que os restos de mielina em preparações de tecido pode obscurecer leituras de citometria de fluxo, e demonstrar que a remoção dos restos de mielina aumenta a sensibilidade de detecção de células imunes no tecido medula lesionada. Tendo estabelecido a sensibilidade do sistema de gradiente OptiPrep para a detecção de células na medula lesionada, que caracteriza-se mudanças na infiltração celular ao longo de um período que varia de 2 horas a 180 dpi e estabeleceu uma resposta multifásica romance de inflamação celular após a LM, que incluiu PMN, macrófagos / microglia e células-T. Tal como confirmado por estudos anteriores 1-3, PMN entrou pela primeira vez o cabo de 2 horas pós-lesão e atingiu um máximo de 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrófagos / microglia por outro lado, 1,4,5, não foram detectadas na medula lesionada até 3 dpi, e chegou inicialmente em sete dpi (Figura 3 e 4). Surpreendentemente, nós mostramos pela primeira vez que os macrófagos / microglia atingiu pela segunda vez a 60 dpi e permaneceu elevada por 180 dpi (Figura 3 e 4). Similar aos macrófagos / microglia, infiltração de células T foi previsto para o pico 05-07 julho dpi, no entanto, citometria de fluxo não detectou qualquer mudança no número de células T nos primeiros 7 dpi, embora um elevado número de células T foi detectada às 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Enquanto T-cell número foi diminuindo em 10 dpi, uma resposta de células T persistente foi observada em 180 dpi, momento em que 4,4% de células foram marcadas para CD3 (Figura 4). Juntos, estes dados demonstram uma resposta dependente do tempo multifásica de inflamação celular após SCI (Figura 4); as fases iniciais de inflamação celular eram compostas do pico precoce de PMNs 1 dpi seguido de um pico de ED1 + macrófagos / microglia 7 dpi e T células-9 dpi, enquanto as fases posteriores eram compostas de três populações celulares subindo depois de 14 dpi e persistindo em 180 dpi, com um pico notável segundo de macrófagos / microglia em 60 dpi. Este estudo timecourse e os dados quantitativos gerados por citometria de fluxo foram validados anteriormente, mostrando resultados comparáveis ​​aos dados coletados de estereologia quantitativa de immunolabeled seções da medula espinhal 1. Tabela 1. Preparação de OptiPrep gradiente para a remoção dos restos mielínicos. Quatro soluções gradiente OptiPrep são feitas com HBSS e OptiPrep diluída (1:1 diluição de OptiPrep e MOPS). Figura 1. Densidades de gradiente OptiPrep mais separados mielina / restos de feridos da medula espinhal tecidos / células e melhorar a avaliação de célula imunológica por citometria de fluxo. (A) A mielina / detritos foi separado a partir de células (neurônios, células gliais e células do sistema imunológico) após a centrifugação do tecido da medula espinhal através dissociada um gradiente OptiPrep seguida de aspiração de mielina / detritos camada. (B) Número de PMN na medula lesionada, mostrando uma maior sensibilidade na detecção de PMNs após a remoção de detritos (Student t-test, p = 0,0001). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso; n = 5 por grupo, média ± SEM. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra. Figura 2. Detecção de infiltração PMN na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, PMNs rapidamente entrou na medula espinhal a partir de 2 horas (B) pós-lesão e pico 1 dpi (C). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso (A). Figura 3. Detecção de macrófagos / microglia infiltração na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, ED1 + número de macrófagos / microglia aumento na medula lesionada a partir de 3 dpi (D), atingiu o pico de forma aguda em 7 dpi (E), caiu para níveis baixos em 14 dpi (F) , antes de subir para um segundo pico em 60 dpi (G), e permaneceu na medula lesionada até 180 dpi (H). IgG rotulagem controle de isotipo de 7 dpi células da coluna (B) mostrou fundo anticorpo rotulagem mínimas e nenhuma diferença para as células-anticorpo rotulado de 2 horas pós-lesão (C) ou não lesionado (A) animais. Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso. Tabela 2. Amostras de animais em experimentos timecourse. Para cada ponto de tempo (0 hr a 180 dpi), cinco animais receberam uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9,e tecidos da medula espinhal foram avaliadas por citometria de fluxo para o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells. No entanto, nem todas as amostras de animais foram recuperados com sucesso para o PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) por citometria de fluxo análises. Figura 4. A timecourse de inflamação celular na medula espinhal após uma lesão contusão moderada (200 kd) em T9. Avaliada por citometria de fluxo, o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells pico de forma aguda (1,7 e 9 dpi, respectivamente) e persistiu cronicamente na medula lesionada. N = 3 a 5 por grupo, média ± SEM.