フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

1。脊髄組織の解離脊髄セグメント以前に1で説明した以外の負傷または挫傷脊髄の負傷のT8 – T10（T9で負傷）Sprague Dawleyラットは、室温で解剖し、HBSSで細かいハサミで機械的に解離された。組織解離に先立ち、全脊髄の列は、コードセグメントT8 – T10の抽出の前に5分間ドライアイス上で維持した。 37℃で遠心分離によって取得された（1分間、1000rpmで、室温）と2.5 mgのトリプシンおよび20分間5ミリリットルDME（ダルベッコ変法イーグル培地）に5 mgのコラゲナーゼで酵素的に解離された組織のビット°粉砕の前にC（〜10倍室温で）ガラスパスツールピペット（9インチ）付き。 DME + 10％ウシ胎児血清10mlの酵素活性を阻害するために細胞に添加し、40μmのセルストレーナーに通して濾過した。クイックスピンした後、細胞ペレットをHBSS 6mlに再懸濁し、OptiPrep勾配のソリューション以下に説明の上で合成。 2。 OptiPrep勾配ソリューションを作成する希釈OptiPrepはMOPSバッファー（0.15 M NaCl、10mMのMOPS、pH7.4）でOptiPrep 1:1に希釈することにより構築した。 四OptiPrep勾配のソリューションは、混合350、250、200、または1ミリリットル（表1）の最終容量にHBSSで150μlの希釈OptiPrepによってなされた。 4つのソリューションは、ゆっくりと慎重に、少なくとも下部に希釈し、上部（図1A）で最も希釈した15 mlコニカルチューブ内のレイヤーに配置した。 3。細胞から脂質/ミエリン破片の分離 HBSSで解離脊髄細胞6mlを注意深くOptiPrep勾配のソリューションの上に重層した。 管を含む細胞と勾配のソリューションは、脂質との別個の層に細胞溶液を分離し、スイングバケットローター（A – 4 – 62）とエッペンドルフ遠心分離機5810Rを使用して（15分、1900 rpmまたは726 RCF、20℃）遠心したペレット中の炎症細胞、グリア、および赤血球と神経細胞の3層、続いて/ミエリンは破片（チューブの上部7 ml）を、。単球、マクロファージ、PMNの顆粒球、リンパ球を含むほとんどの炎症性細胞は、ペレットで発見されたものの、一部の大型活性化マクロファージは、ペレット上の層で見つけることができる。 脂質/ミエリン破片の層（上位7 ml）を注意深く吸引して除去した。次いで、細胞を洗浄し、2.5mlのHBSSに再懸濁し、下記の免疫標識に使用した。 4。フローサイトメトリーのために特定の免疫細胞の免疫標識脊髄の調製物から採取した細胞（500μl）をペレット化し、赤血球を溶解するために5分間0.85％塩化アンモニウム（蒸留水で希釈）に再懸濁した。 細胞を500μlのHBSSで洗浄し、室温で正常ウサギやマウスの血清で30分間ブロッキングした。 またはで希釈したアイソタイプIgG溶液セルが1抗体との時間（;マウス抗ラットED1アレクサ488、Serotecまたはマウス抗ラットCD3をアレクサ488ウサギ抗- PMN FITC、正確な化学と科学）のために洗浄し、室温でインキュベートしたHBSSは（1:100希釈ですべて）、前述1に記載。 細胞は、最終ステップの後に300μlのHBSSに再懸濁し、上記とし、各ステップの後に二回洗浄した。 5。フローサイトメトリーによる細胞定量的評価サンプルは、セルクエストソフトウェアを使用してFACSキャリバー（ベクトン- Dickinson社）フローサイトメーターで分析した。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいた、とデータ解析は、サミット（DakoCytomation）で完成しました。 フローサイトメトリーゲートは、以前は次の1に記載のように時間のポイント間での正規化のためのベースライン値を設定するには、無傷の対照動物からコントロールIgGアイソタイプ標識細胞や脊髄細胞を用いて設定されていました。積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。 6。代表的な結果： ミエリン破片を除去し、フローサイトメトリーによる免疫細胞の検出を向上させるためにOptiPrep勾配の能力は、1解像度（図1B）、SCI 1月3日後のPMN浸潤の以前に報告されたピーク時に脊髄PMNはを定量化することによって評価した。また、同じ解剖脊髄は、ミエリン破片のOptiPrep除去することなく酵素的に解離し、同様にフローサイトメトリーによるPMN浸潤を並列に評価した。我々は以前に1を報告しているように、単独で酵素的解離に比べOptiPrep勾配精製法で分離した試料中のイベントの位置にずれがあった、無傷のミエリンの残骸のサンプルで検出されたPMNの割合を示すことはほんの一部（0.5％）であったOptiPrep purifで検出されたPMNの割合（5.1％）のIEDのサンプル（図1B）。これらのデータは、損傷した脊髄組織における免疫細胞の検出の感度を高める組織調製物中のミエリン破片がフローサイトメトリーの測定値をあいまいにし、ミエリンの破片のその除去を実証できることを示唆している。 損傷した脊髄の細胞検出のためのOptiPrep勾配系の感度を確立した後、我々は2時間から180 dpiに至るまでの期間にわたって細胞浸潤の変化を特徴とし、PMNは、マクロファージを含むSCI後の細胞の炎症の新たな多面的な応答を設立/ミクログリアとT -細胞。として1から3までの研究によって確認された、PMNは、最初の2時間後に傷害でコードを入力し、1解像度（図2＆4）でピークに達した。一方、マクロファージ/ミクログリア1,4,5は 、3解像度まで、脊髄損傷の検出、および7解像度（図3＆4）で最初にピークを迎えていませんでした。驚いたことに、我々はマクロファージ/ミクログリア第二時間60 dpiのピークと180解像度（図3＆4）を介して上昇残ったことを初めて示す。マクロファージ/ミクログリアと同様に、T細胞の浸潤は7解像度5-7ピークに達すると予測された、T -細胞の上昇数が検出されたもののしかし、フローサイトメトリーは、最初の7解像度のT細胞数の変化を検出しなかった9時解像度（1.6％）（図4）。 T細胞数が10解像度が減少した一方で、永続的なT細胞応答は細胞の4.4％がCD3（図4）のために標識した時点で180解像度、で観察した。 一緒に、これらのデータは、SCI後の細胞性炎症（図4）の時間依存性の多面的な応答を示し、細胞の炎症の初期段階は、解像度がED1のピークが続くPMNは1の初期のピークから成っていた+マクロファージ/ミクログリア7解像度及びT細胞9解像度、後での段階は、60 dpiでマクロファージ/ミクログリアの注目に値する番目のピークと、14 dpiと180解像度を通じて持続した後に上昇し、3つの細胞集団で構成されている。このtimecourseの研究およびフローサイトメトリーによって生成された定量的データは、免疫標識脊髄のセクション1の定量的な立体学から収集したデータに匹敵する結果を示し、以前に検証されています。 表1。ミエリンの破片を除去するためのOptiPrep勾配の準備。四OptiPrep勾配のソリューションをHBSSおよび希薄化後OptiPrep（OptiPrepとMOPSの1:1希釈）を使用して行われる。 図1。OptiPrep勾配の密度別のほとんどのミエリン/脊髄損傷の組織/細胞からの破片やフローサイトメトリーによる免疫細胞の評価を改善。 （A）ミエリン/残骸は、ミエリン/残骸層の吸引に続いOptiPrepの勾配を通じて解離脊髄組織の遠心分離後の細胞（ニューロン、グリアおよび免疫細胞）から分離した。脊髄損傷における（B）PMN番号、瓦礫撤去後のPMNが検出における感度の向上（スチューデントのt -検定、p = 0.0001）を示す。 nはグループごとに= 5、平均± SEM、すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいたし、積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。 図2フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるPMN浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後に、PMNがすぐに2時間（B）後の傷害を開始し、1解像度（C）のピーク脊髄に入った。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物（）から標識された細胞を使用して設定された。 図3。マクロファージ/フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるミクログリアの浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後、ED1 +マクロファージ/ミクログリア数は、解像度（D）3から脊髄損傷で増加して7解像度（E）で急性ピークに、14解像度（F）で低レベルに低下、前に60解像度（G）の第二ピークに上昇し、最大180解像度（H）に脊髄損傷にとどまった。 7解像度脊髄細胞のIgGアイソタイプのコントロールのラベル（B）は、最小限の抗体標識の背景と2時間からの抗体 – 標識された細胞のポスト外傷（C）または無傷（A）動物に違いを示した。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。 表2。 timecourse実験における動物のサンプルは、各時点（0時間180解像度）は、5匹の動物は、T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害を受けたと脊髄組織はPMNは、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、およびCD3 + T細胞の数のためにフローサイトメトリーによって評価した。ただし、すべての動物の試料はPMN（4-5）、ED1（3-5）、およびCD3（4-5）フローサイトメトリー分析のために正常に回復した。 図4。T9で中等度（200 KD）挫傷の傷害後脊髄の細胞の炎症のtimecourse。として、フローサイトメトリー、PMNの数字、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、及びCD3によって評価+ T細胞急性ピーク（それぞれ1,7、および9解像度、）と脊髄損傷で慢性的に持続した。nは = 3〜5％グループは、平均± SEM。