La valutazione quantitativa delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale mediante citometria di flusso: un nuovo uso per un metodo di purificazione cellulare

1. Dissociazione del tessuto del midollo spinale Segmenti del midollo spinale T8-T10 di non feriti o contusione del midollo spinale danneggiato (lesione al T9) ratti Sprague Dawley sono stati sezionati e dissociato meccanicamente con le forbici bene in HBSS a temperatura ambiente, come descritto in precedenza 1. Prima di dissociazione dei tessuti, intere colonne del midollo spinale sono stati tenuti in ghiaccio secco per 5 minuti prima dell'estrazione dei segmenti cavo T8-T10. Frammenti di tessuti che sono stati recuperati per centrifugazione (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociato con 2,5 mg di tripsina e 5 collagenasi mg in 5 ml DME (Dulbecco Modified Eagle Media) per 20 minuti a 37 ° C prima di triturazione (~ 10 volte a temperatura ambiente) con una pipetta Pasteur di vetro (9-pollici). 10 ml di DME + 10% di siero fetale bovino è stato aggiunto alle cellule di inibire l'attività enzimatica e poi è stato filtrato attraverso un colino cellula 40 micron. Dopo un giro veloce, il pellet è stato risospeso in 6 ml di HBSS e sovrapposto OptiPrep soluzioni gradiente descritto di seguito. 2. Creazione OptiPrep soluzioni gradiente Diluito OptiPrep è stato costruito diluendo OptiPrep 1:1 con tampone MOPS (0,15 M di NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4). Quattro OptiPrep soluzioni gradiente sono state fatte da mescolando 350, 250, 200, o 150 microlitri OptiPrep diluito con HBSS ad un volume finale di 1 ml (Tabella 1). I quattro soluzioni sono state lentamente e con attenzione disposti a strati in un tubo da 15 ml con il minimo diluire in basso e il più diluire in alto (Figura 1A). 3. Separare lipidi / mielina detriti dalle cellule 6 ml di cellule dissociate spinale in HBSS stato accuratamente a strati sopra di soluzioni del gradiente OptiPrep. Provetta contenente le cellule e le soluzioni gradiente è stato centrifugato (15 minuti, 1900 rpm o 726 RCF, 20 ° C) utilizzando una centrifuga Eppendorf 5810R con un rotore basculante (A-4-62), separando la soluzione cella in strati distinti con i lipidi / detriti mielina (in alto 7 ml di tubo), seguita da 3 strati di neuroni, con le cellule infiammatorie, glia, e globuli rossi nel pellet. Sebbene la maggior parte delle cellule infiammatorie, tra cui monociti, macrofagi, granulociti PMN e linfociti sono stati trovati nel pellet, alcuni di grandi dimensioni-macrofagi attivati ​​è stato trovato in strati sopra il pellet. La lipidi / strato di mielina detriti (in alto 7 ml) è stato accuratamente aspirati e rimossi. Le cellule sono state poi lavate e risospese in 2,5 ml HBSS e utilizzati per immunomarcatura sotto. 4. Immunomarcatura di specifiche cellule del sistema immunitario per la citometria a flusso Cellule (500 microlitri) raccolti da preparativi del midollo spinale sono stati pellettato e risospesi in cloruro di ammonio 0,85% (diluito in acqua distillata) per 5 minuti per lisare i globuli rossi. Le cellule sono state lavate con 500 microlitri HBSS e poi bloccata per 30 minuti in coniglio normale o nel siero del mouse a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate e incubate a temperatura ambiente per 1 ora con anticorpi (anti-coniglio PMN FITC, chimica accurato e scientifico; topo anti-ratto ED1 Alexa 488, Serotec; o Mouse anti-ratto CD3 Alexa 488) o isotipo IgG soluzione diluita in HBSS (tutti in diluizione 1:100), come descritto in precedenza 1. Le cellule sono state lavate due volte dopo ogni passo sopra e poi risospeso in 300 microlitri HBSS dopo il passo finale. 5. Valutazione quantitativa delle cellule mediante citometria di flusso I campioni sono stati analizzati su un FACS Calibur (Becton-Dickinson) citofluorimetro utilizzando Quest software cellulare. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e analisi dei dati è stata completata con Summit (DakoCytomation). Porte citometria a flusso sono stati fissati con il controllo delle cellule isotipo IgG etichettati o cellule del midollo spinale di animali di controllo indenne per impostare i valori di base per la normalizzazione attraverso punti di tempo come descritto in precedenza 1. I valori medi di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell'intero campione. 6. Rappresentante dei risultati: La capacità di un gradiente OptiPrep per rimuovere i detriti della mielina e migliorare la rilevazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso è stata valutata attraverso la quantificazione PMN spinale a 1 dpi (Figura 1B), il picco precedentemente segnalati di infiltrazioni PMN dopo SCI 1-3. In alternativa, identicamente sezionato il midollo spinale erano dissociate enzimaticamente senza OptiPrep-rimozione dei detriti mielina e sono stati valutati allo stesso modo in parallelo per infiltrazioni PMN mediante citometria di flusso. Come abbiamo riportato precedentemente 1, ci fu un cambiamento nella posizione degli eventi in campioni isolati con il metodo del gradiente di purificazione OptiPrep rispetto alla dissociazione enzimatica da solo, dimostrando la percentuale di PMN rilevati nei campioni con intatta debris mielina era solo uno frazione (0,5%) della percentuale di PMN rilevati (5,1%) in OptiPrep purifcampioni IED (Figura 1B). Questi dati suggeriscono che i detriti mielina nei preparati di tessuto può oscurare letture di citometria a flusso, e dimostrare che la rimozione dei detriti mielina aumenta la sensibilità di rilevazione delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale. Dopo aver stabilito la sensibilità del sistema gradiente OptiPrep per il rilevamento delle cellule nel midollo spinale danneggiato, abbiamo caratterizzato i cambiamenti in infiltrazione cellulare per un periodo che varia da 2 ore a 180 dpi e ha stabilito una risposta romanzo multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI che comprendeva PMN, macrofagi / microglia e T-cellule. Come confermato da studi precedenti 1-3, PMN primo ingresso il cavo a 2 ore di post-infortunio e ha alzato a 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrofagi / microglia invece 1,4,5, non sono stati rilevati nel midollo spinale lesionato fino a 3 dpi, e un picco inizialmente a 7 ​​dpi (Figura 3 e 4). Sorprendentemente, si mostra per la prima volta che i macrofagi / microglia picco per la seconda volta 60 dpi ed è rimasta elevata di 180 dpi (Figura 3 e 4). Simile a macrofagi / microglia, cellule T infiltrazione è stato previsto il picco 05-07 luglio dpi, tuttavia, la citometria a flusso non rileva le modifiche nel numero delle cellule T nei primi 7 dpi, anche se un elevato numero di cellule T è stata rilevata a 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Mentre il numero delle cellule T è stata diminuzione di 10 dpi, una persistente risposta delle cellule T è stata osservata di 180 dpi, momento in cui il 4,4% delle cellule sono stati etichettati per CD3 (Figura 4). Insieme, questi dati dimostrano un dipendente dal tempo di risposta multifasico di infiammazione cellulare dopo SCI (Figura 4), le fasi iniziali di infiammazione cellulare erano comprende il picco precoce di PMN 1 dpi seguito da un picco di ED1 + macrofagi / microglia 7 dpi e T 9-celle dpi, mentre le fasi successive erano composte da tutte e tre le popolazioni cellulari in aumento dopo 14 dpi e persistente di 180 dpi, con un picco notevole seconda macrofagi / microglia a 60 dpi. Questo studio timecourse ed i dati quantitativi generati mediante citometria di flusso sono state convalidate in precedenza, che mostrano risultati comparabili ai dati raccolti da stereologia quantitativo di immunolabeled sezioni del midollo spinale 1. Tabella 1. Preparazione del gradiente OptiPrep per la rimozione di detriti mielina. Quattro soluzioni gradiente OptiPrep sono realizzati con HBSS OptiPrep e diluito (1:1 diluizione OptiPrep e MOPS). Figura 1. Gradiente di densità OptiPrep separati più mielina / detriti dalla ferita del midollo spinale tessuti / cellule e migliorare la valutazione delle cellule immunitarie mediante citometria di flusso. (A) La mielina / detriti è stato separato dalle cellule (neuroni, cellule gliali e cellule del sistema immunitario) dopo centrifugazione del dissociato tessuto del midollo spinale attraverso un gradiente OptiPrep seguita da aspirazione di mielina / strato di detriti. (B) numero di PMN nel midollo spinale danneggiato, mostrando una maggiore sensibilità nel rilevare PMN dopo la rimozione detriti (Student t-test, p = 0,0001). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso; n = 5 per gruppo, media ± SEM. 5.000 eventi per campione sono stati letti per tutti i campioni e il valore medio di cellule positivamente etichettati sono stati espressi come percentuale (± SEM) dell'intero campione. Figura 2. Rilevamento di infiltrazioni PMN nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, PMN rapidamente entrato nel midollo spinale di partenza 2 ore (B) post-infortunio e con un picco 1 dpi (C). Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali indenni (A). Figura 3. Rilevazione dei macrofagi / microglia infiltrazione nel midollo spinale danneggiato mediante citometria di flusso. Dopo un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9, ED1 + macrofagi / microglia numero maggiore nel midollo spinale danneggiato a partire da 3 dpi (D), ha raggiunto il picco acutamente a 7 dpi (E), è sceso a livelli bassi a 14 dpi (F) , prima di risalire ad un secondo picco a 60 dpi (G), ed è rimasto nel midollo spinale lesionato fino a 180 dpi (H). IgG etichettatura controllo isotipo di 7 celle dpi spinale (B) hanno anticorpi minimo di etichettatura sfondo e nessuna differenza per le cellule anticorpo marcato da 2 ore post-infortunato (C) o indenne (A) gli animali. Tutte le porte citometria a flusso sono stati impostati utilizzando cellule marcate da animali illeso. Tabella 2. Campioni di animali negli esperimenti timecourse. Per ogni punto temporale (0 hr a 180 dpi), cinque animali hanno ricevuto un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9,e del midollo spinale sono stati valutati mediante citometria di flusso per il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule. Tuttavia, non tutti i campioni animali sono stati recuperati con successo da PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) analizza citometria a flusso. Figura 4. Un timecourse di infiammazione cellulare nel midollo spinale a seguito di un moderato (200 kd) lesioni contusione al T9. Valutata mediante citometria di flusso, il numero di PMN, ED1 + macrofagi / microglia, e CD3 + T-cellule ha raggiunto un picco acuto (1,7, e 9 dpi, rispettivamente) e persistito cronicamente nel midollo spinale danneggiato. N = 3 al 5 per gruppo, media ± SEM.