הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell
Summary
כימות של דלקת הסלולר ב CNS פצועים / פתולוגי על ידי cytometry זרימה מסובך ידי פסולת שומנים / מיאלין כי יכול להיות בגודל פרור דומים לתאים, הפחתת הרגישות / דיוק. יש לנו הכנה מתקדמים תא שיטה להסרת פסולת המיאלין ולשפר זיהוי תאים על ידי זרימת cytometry בחוט השדרה הפגוע.
Abstract
איתור של תאים חיסוניים במערכת נפצעו העצבים המרכזית (CNS) באמצעות טכניקות מורפולוגיים או היסטולוגית לא סיפקה תמיד ניתוח כמותי נכון של דלקת הסלולר. Cytometry זרימה היא שיטה חלופית מהירה לכמת תאים חיסוניים במוח פצוע או רקמת חוט השדרה. מבחינה היסטורית, cytometry זרימה שימש לכמת תאים חיסוניים שנאספו דם או הטחול מנותק או התימוס, ורק מספר מחקרים ניסו לכמת תאים חיסוניים בחוט השדרה נפגע cytometry זרימה באמצעות חוט רקמה טרי ניתק. עם זאת, הרקמה ניתק חוט השדרה מרוכזת בפסולת המיאלין אשר ניתן בטעות תאים ולהפחית אמינות לספור תא מתקבל על ידי cytometer את הזרימה. יש לנו הכנה מתקדמים תא שיטה באמצעות מערכת שיפוע OptiPrep כדי פסולת ביעילות שומנים / המיאלין נפרד מן התאים, מתן quantifications רגיש ואמין של דלקת הסלולר בחוט השדרה נפגע cytometry הזרימה. כפי שתואר מחקר שנערך לאחרונה שלנו (Beck & נגוין ואח', המוח פבואר 2010; 133 (Pt 2):.. 433-47), הכנת תא OptiPrep עלה רגישות לזהות דלקת הסלולר בחוט השדרה נפגעים, עם סעיפים של תא סוגים ספציפיים correlating עם חומרת הפציעה. אנושות, השימוש הרומן של שיטה זו סיפקה את האפיון הראשון של דלקת הסלולר אקוטי וכרוני לאחר SCI לכלול קורס הזמן המלא ל leukocytes polymorphonuclear (PMNs, נויטרופילים), מקרופאגים / microglia, ו-T-תאים על פני תקופה שבין 2 שעות 180 ימים לאחר פציעה (dpi), זיהוי שלב הרומן המפתיע השני של דלקת הסלולר. אפיון יסודי של דלקת הסלולר באמצעות שיטה זו עשויה לספק הבנה טובה יותר של neuroinflammation ב CNS נפצעו, ולחשוף מרכיב חשוב של multiphasic neuroinflammation שעשויה להיות קריטית לעיצוב ויישום אסטרטגיות טיפול רציונלי טיפולית, כולל שני תאים מבוססי תרופתי התערבויות של SCI.
Protocol
Discussion
השימוש cytometry זרימה לכמת תאים חיסוניים CNS מורכבת לפי תוכן שומנים / המיאלין ופסולת. בנוסף להפריע מחייב נוגדנים וספציפיות, פסולת המיאלין יכולה להיות בגודל דומה ומאפיינים פרור לתאי מערכת החיסון, הפחתת רגישות המדידה דיוק 8. התא הרומן הכנה השיטה המתוארת כאן הוא יעיל בהסרת פסולת המיאלין ובכך משפרת את הרגישות של זרימת cytometry לזהות שינויים דלקת הסלולר בחוט השדרה הפגוע. למשל, פינוי פסולת המיאלין על ידי זיהוי בשיטה זו משופר של תאים חיסוניים לעומת דיסוציאציה האנזימטית alone.Critically, השימוש הרומן של שיטה זו אפשרה את האפיון הראשון של דלקת הסלולר אקוטי וכרוני לאחר SCI לכלול קורס הזמן המלא ל PMNs, מקרופאגים / microglia, ו-T-תאים עד 180 dpi, וזיהה השלב השני של הרומן דלקת הסלולר. ממצאים אלה חשובים של רכיב multiphasic של neuroinflammation עשוי להיות קריטי עבור התכנון והיישום של רציונלי אסטרטגיות טיפול רפואי, כולל התערבויות שני תאים מבוססי תרופתי עבור SCI.
המערכת שיפוע OptiPrep נעשה שימוש כדי להפריד פסולת מתאי דם 9, או נוירונים לטהר מהמוח לתרבות למטרות תא 10, אך יש לנו שונה ומתקדמת מערכת זו שיטה להפרדת פסולת מתאי המיאלין ניתק את חוט השדרה, ואיפשר כימות מהיר ומדויק יותר של דלקת הסלולר על ידי cytometry הזרימה. שיטה זו יחד עם cytometry זרימת צפוי לספק התקדמות משמעותית בחקר דלקת לאחר פציעות CNS או במצבים פתולוגיים, כמו רוב המחקרים הגדירו רק דלקת הסלולר של מערכת העצבים המרכזית באמצעות טכניקות מורפולוגיים היסטולוגית שאינם תאים מסוג מסוים או לא תמיד יכולים לספק נכון הערכה כמותית. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו לכמת תאים חיסוניים בחוט השדרה נפגע cytometry זרימה באמצעות חוט רקמה טרי ניתק 11,12 או תאים המופרדים באמצעות השיפוע Percoll מערכת 13, אולם מחקרים אלו הראו גם התשואות התא נמוכה או רגישות זיהוי של תאים חיסוניים.
לעומת זאת, תא שיפוע OptiPrep שיטת הכנה סיפקה לראשונה, הערכה כמותית רגיש ואמין על ידי זרימת cytometry שינויים של דלקת הסלולר בתגובה חומרת הפגיעה מדורגת מעל timecourse מורחבת עד 180 dpi. הרגישות והאמינות של ניתוח תזרים cytometric תלוי גם הספציפיות של נוגדנים לשמש כדי לזהות סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, כמו cytometry הזרימה אינה מתירה קריטריונים מורפולוגיים נוספת להבחין בין סוגי תאים. הספציפיות של נוגדנים PMNs, מקרופאגים / microglia או T-אומר נבדק ביסודיות על PMNs הצפק ומקרופגים מכתשיים בתרבות תאים 1,2 רקמת חוט השדרה נפגע ב cytometry הזרימה. יחד עם מערכת שיפוע OptiPrep, נוגדנים אלה המשמשים cytometry זרימה תרמו הדור ניתוח כמותי הזמני של דלקת הסלולר סיפקה תובנה חדשה על הדינמיקה של microenvironment SCI, וזיהו לראשונה מענה multiphasic המורחבת דלקת הסלולר. זו התגובה של תאים multiphasic לאחר SCI עשוי להיות חשוב לחקור את תפקידם של סוגי תאים מסוימים נוכח בזמנים מסוימים לאחר פציעה או ליצור התערבויות טיפוליות נגד סוגי תאים ספציפיים שיכולים להחמיר פציעות. יתר על כן, ממצאים אלה עשויים לסייע בפיתוח של הרציונל מתאים התערבויות סמים או מבוססי תאים אופטימלי SCI.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים רבקה נישי, MS, טכנאים המתקן & כריסטופר ודנה ריב קרן בעלי חיים Core באוניברסיטת קליפורניה על עזרתם בניתוח של בעלי חיים. אנו מודים גם גבריאלה פינס, אושה Nekanti ו Denisse מורנו להכנות, סיוע כתב היד ווידאו טכנית לירות ואנימציה. מחקר זה נתמך על ידי NINDS (RO1 NS43428-01 ל AJA), פרויקט שיתוק של אמריקה (PPA-32574 כדי HXN), ו קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) לתאי גזע הדרכה פרס T1-00008 כדי HXN. KDB נתמך על ידי תוכנית אימונים מולקולרית תאית המוח באוניברסיטת קליפורניה (T32 NS007444).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 |
| HBSS | Sigma | H1387 |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific | AIFAD51140 |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F |
| Trypsin | Sigma | T9935 |
| Collagenase | Sigma | C5138 |
| DME | Sigma | D1152 |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler’s virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
