Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

1. Dissoziation von Rückenmark Rückenmarksegmente T8-T10 von nicht verletzt oder Quetschung des Rückenmarks verletzt (Verletzung am T9) Sprague Dawley Ratten wurden seziert und mechanisch dissoziiert mit einer feinen Schere in HBSS bei Raumtemperatur, wie zuvor 1 beschrieben. Vor Gewebedissoziation wurden ganze Rückenmark Spalten auf Trockeneis für 5 Minuten vor der Extraktion der Schnur Segmente T8-T10 gehalten. Tissue-Bits wurden durch Zentrifugation (1 Minute, 1000 rpm, Raumtemperatur) und enzymatisch gespalten mit 2,5 mg Trypsin und 5 mg Kollagenase in 5 ml DME (Dulbecco modifiziertem Eagle-Media) für 20 Minuten bei 37 ° C vor der Trituration (abgerufen ~ 10 Mal bei Raumtemperatur) mit einem Glas Pasteurpipette (9-Zoll). 10 ml DME + 10% fötalem Rinderserum wurde, um Zellen hinzugefügt, um Enzymaktivitäten hemmen und wurde dann durch ein 40 um Zellsieb gefiltert. Nach einer schnellen Spin, wurde das Zellpellet in 6 ml HBSS resuspendiert und überlagert auf OptiPrep Gradienten-Lösungen beschrieben. 2. Erstellen OptiPrep Gradienten-Lösungen Das verwässerte OptiPrep wurde durch Verdünnung OptiPrep 1:1 mit MOPS-Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) gebaut. Vier OptiPrep Gradienten-Lösungen wurden durch Mischen von 350, 250, 200 oder 150 ul verdünnt OptiPrep mit HBSS auf ein Endvolumen von 1 ml (Tabelle 1). Die vier Lösungen wurden langsam und vorsichtig in Schichten in einem 15 ml konischen Röhrchen gegeben mit der geringsten Verdünnung auf den Boden und die meisten verdünnten auf der Oberseite (Abbildung 1A). 3. Die Trennung Lipid / Myelin Trümmer von Zellen 6 ml dissoziierter spinalen Zellen in HBSS wurde sorgfältig auf der Oberseite des OptiPrep Gradienten Lösungen geschichtet. Röhrchen mit Zellen und Gradienten-Lösungen wurde zentrifugiert (15 Minuten, 1900 rpm oder 726 RCF, 20 ° C) mit einer Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit einem Ausschwingrotor (A-4 bis 62), die Trennung der Zell-Lösung in verschiedene Schichten mit Lipid / Myelin Trümmer (top 7 ml Tube), gefolgt von 3 Schichten von Neuronen, die mit entzündlichen Zellen, Gliazellen, und die roten Blutkörperchen in das Pellet gefolgt. Obwohl die meisten entzündlichen Zellen, einschließlich Monozyten, Makrophagen, PMN Granulozyten und Lymphozyten in das Pellet gefunden wurden, könnten einige großformatige-aktivierten Makrophagen in Schichten oberhalb des Pellet gefunden werden. Die Lipid / Myelin Trümmer Schicht (oben 7 ml) wurde vorsichtig abgesaugt und abgeführt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 2,5 ml HBSS und für Immunomarkierung unten. 4. Immunomarkierung von spezifischen Immunzellen für die Durchflusszytometrie Cells (500 ul) aus Rückenmark Präparate gesammelt wurden pelletiert und in 0,85% Ammoniumchlorid (verdünnt in destilliertem Wasser) für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Die Zellen wurden mit 500 ul HBSS gewaschen und anschließend für 30 Minuten in normales Kaninchen oder Maus-Serum bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden gewaschen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Antikörper (Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical und Scientific; Maus anti-Ratte ED1 Alexa 488, Serotec, oder Maus-anti-Ratte CD3 Alexa 488) oder Isotyp IgG-Lösung verdünnt in HBSS (alle bei 1:100 Verdünnung), wie zuvor beschrieben 1. Die Zellen wurden zweimal nach jedem Schritt vor und dann in 300 ul HBSS nach dem letzten Schritt resuspendiert. 5. Zell-quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie Die Proben wurden auf einem FACS Calibur (Becton-Dickinson) Durchflusszytometer mit Cell Quest Software analysiert. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen, und Daten-Analyse wurde mit Summit (DakoCytomation) abgeschlossen. Durchflusszytometrische Tore gesetzt wurden mit Kontroll-IgG Isotyp markierten Zellen oder Rückenmark Zellen aus unverletzten Kontrolltieren zu den Ausgangswerten für die Normalisierung über Zeitpunkte festlegen, wie vorher beschrieben 1. Die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Fähigkeit eines OptiPrep Gradienten Myelin Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Immunzellen Detektion mittels Durchflusszytometrie wurde durch Quantifizierung der Wirbelsäule PMNs bei 1 beurteilt dpi (Abbildung 1B), die zuvor berichteten Höhepunkt der PMN-Infiltration nach SCI 1-3. Alternativ wurden identisch seziert Rückenmark enzymatisch gespalten, ohne OptiPrep-Entfernung von Myelin Trümmer und wurden in ähnlicher Weise parallel zur PMN-Infiltration mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie wir bereits 1 berichtet haben, gab es eine Verschiebung der Position der Ereignisse in Proben mit OptiPrep Gradientenreinigung Methode im Vergleich zu enzymatischen Dissoziation allein isoliert, demonstrierte der Anteil der PMN in Proben mit intakten Myelin Trümmer entdeckt nur ein Bruchteil (0,5%) der Anteil der PMN festgestellt (5,1%) in OptiPrep purifIED Proben (Abbildung 1B). Diese Daten legen nahe, dass Myelin Trümmer im Gewebe Zubereitungen können durchflusszytometrischen Messungen dunkel, und zeigen, dass das Entfernen von Myelin Trümmer verbessert die Empfindlichkeit von Immunzellen Erkennung in das verletzte Rückenmark Gewebe. Nachdem festgestellt wurde, die Empfindlichkeit des OptiPrep Gradientensystem für die Zell-Erkennung in das verletzte Rückenmark, charakterisierten wir Veränderungen in der zellulären Infiltration über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 180 dpi und gründete eine neue mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung, die PMN, Makrophagen aufgenommen / Mikroglia und T-Zellen. Wie frühere Studien 1-3 bestätigt, PMNs zuerst in das Kabel um 2 Uhr nach der Verletzung und erreichte bei 1 dpi (Abb. 2 & 4). Makrophagen / Mikroglia auf der anderen Seite 1,4,5, wurden nicht in das verletzte Rückenmark bis 3 dpi erkannt, und erreichte zunächst bei 7 dpi (Abbildung 3 und 4). Überraschenderweise zeigen wir zum ersten Mal, dass Makrophagen / Mikroglia zum zweiten Mal 60 dpi Höhepunkt und blieb erhöhten durch 180 dpi (Abbildung 3 und 4). Ähnlich wie Makrophagen / Mikroglia, T-Zell-Infiltration wurde vorhergesagt, bis 7 dpi 5-7 Spitze, aber Durchflusszytometrie zeigten keinen Veränderungen in der T-Zell-Zahl in den ersten 7 dpi, obwohl eine erhöhte Anzahl von T-Zellen erkannt wurde um 9 dpi (1,6%) (Abbildung 4). Während T-Zellzahl um 10 dpi, eine anhaltende T-Zell-Antwort wurde durch 180 dpi beobachtet, zu welchem ​​Zeitpunkt 4,4% der Zellen für CD3 (Abbildung 4) wurden als rückläufig. Zusammen zeigen diese Daten eine zeitabhängige mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach SCI (Abbildung 4); den ersten Phasen der zellulären Entzündung wurden von den frühen Höhepunkt der PMNs 1 enthielt dpi, gefolgt von einem Spitzenwert von ED1 + Makrophagen / Mikroglia 7 dpi und T -Zellen 9 dpi, während die späteren Phasen wurden von allen drei Zellpopulationen steigende nach 14 dpi und persistierende durch 180 dpi, mit einer bemerkenswerten zweiten Peak von Makrophagen / Mikroglia bei 60 dpi zusammen. Dieser Zeitverlauf studieren und die quantitativen Daten mittels Durchflusszytometrie generiert wurden zuvor validierten zeigen vergleichbare Ergebnisse, Daten aus quantitativen Stereologie von immunolabeled Rückenmark Abschnitte 1 gesammelt. Tabelle 1. Vorbereitung der OptiPrep Gradienten für die Entfernung von Myelin Trümmer. Four OptiPrep Gradienten-Lösungen werden mit HBSS verdünnt und OptiPrep (1:1 Verdünnung OptiPrep und MOPS). Abbildung 1. OptiPrep Gradienten Dichten trennen meisten Myelin / Trümmer verletzten Rückenmarks Gewebe / Zellen und verbessern Immunzellen Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. (A) Myelin / Schutt wurde aus Zellen (Neuronen, Glia-und Immunzellen) nach Zentrifugation dissoziierter Rückenmark durch eine OptiPrep Gradienten durch Aspiration von Myelin / Schüttschichtfiltertechnik gefolgt getrennt. (B) PMN Zahl in das verletzte Rückenmark, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Erkennung PMNs nach Schmutzentfernung (Student-t-Test, p = 0,0001). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere; n = 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen und die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. Abbildung 2. Erkennung von PMN-Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, PMNs schnell in das Rückenmark ab 2 Stunden (B) nach der Verletzung und Peaking 1 dpi (C). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere (A). Abbildung 3. Erkennung von Makrophagen / Mikroglia Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, ED1 + Makrophagen / Mikroglia Zahl in das verletzte Rückenmark erhöht ab 3 dpi (D), erreichte akut bei 7 dpi (E) sank auf ein niedriges Niveau bei 14 dpi (F) , bevor sie sich zu einem zweiten Peak bei 60 dpi (G), und blieb in das verletzte Rückenmark bis zu 180 dpi (H). IgG Isotyp-Kontroll-Kennzeichnung von 7 dpi spinalen Zellen (B) zeigte minimale Antikörper-Kennzeichnung Hintergrund und keinen Unterschied zu Antikörper-markierte Zellen aus 2 Stunden post-Verletzten (C) oder unverletzt (A) Tiere. Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere. Tabelle 2. Tierische Proben in Zeitverlauf Experimente. Für jeden Zeitpunkt (0 h bis 180 dpi), erhielt fünf Tiere einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9,und Rückenmark Gewebe wurden mittels Durchflusszytometrie für die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 + T-Zellen untersucht. Allerdings waren nicht alle tierischen Proben erfolgreich für PMN (4-5), ED1 (3-5) und CD3 (4-5) mittels Durchflusszytometrie analysiert erholt. Abbildung 4. Ein Zeitverlauf der zellulären Entzündung im Rückenmark nach einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9. Wie mittels Durchflusszytometrie, die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 beurteilt + T-Zellen erreichte akut (1,7 und 9 dpi, jeweils) und blieb chronisch in das verletzte Rückenmark. N = 3 bis 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM.