Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

1. Dissociatie van ruggenmergweefsel Ruggenmerg segmenten T8-T10 van niet-gewonde of kneuzing ruggemerglaesie (verwonding op T9) Sprague Dawley ratten werden ontleed en mechanisch gescheiden met fijne schaar in HBSS bij kamertemperatuur, zoals eerder beschreven: 1. Voorafgaand aan weefsel dissociatie, werden hele ruggenmerg columns gehouden op droog ijs gedurende 5 minuten voor de winning van koord segmenten T8-T10. Tissue stukjes werden opgehaald door centrifugeren (1 minuut, 1000 rpm, kamertemperatuur) en enzymatisch gedissocieerd met 2,5 mg trypsine en 5 mg collagenase in 5 ml DME (Dulbecco's Modified Eagle's Media) gedurende 20 minuten bij 37 ° C voor tritureren (~ 10 keer bij kamertemperatuur) met een glas Pasteur pipet (9-inch). 10 ml van DME + 10% foetaal runderserum werd toegevoegd aan cellen om enzymatische activiteiten te remmen en daarna werd gefilterd door een 40 um cel zeef. Na een snelle draai, was de cel pellet geresuspendeerd in 6 ml HBSS en overlayed op OptiPrep helling oplossingen die hieronder worden beschreven. 2. Het creëren van OptiPrep gradiënt-oplossingen Verdund OptiPrep werd gebouwd door verdunning OptiPrep 1:1 met MOPS buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4). Vier OptiPrep gradiënt oplossingen werden gemaakt door het mengen van 350, 250, 200 of 150 ul verdund met HBSS OptiPrep tot een eindvolume van 1 ml (tabel 1). De vier oplossingen werden langzaam en voorzichtig in lagen in een 15 ml conische buis met de minste verdund op de bodem en het meest verdund op de bovenste (Figuur 1A). 3. Scheiden van lipiden / myeline brokstukken van cellen 6 ml van gescheiden spinale cellen in HBSS werd zorgvuldig lagen op de top van de OptiPrep gradiënt oplossingen. Buis met cellen en gradiënt-oplossingen werd gecentrifugeerd (15 minuten, 1900 rpm of 726 RCF, 20 ° C) met behulp van een Eppendorf Centrifuge 5810R met een swing-emmer rotor (A-4-62), het scheiden van de cel-oplossing in verschillende lagen met lipide / myeline puin (top 7 ml van de buis), gevolgd door drie lagen van neuronen, met ontstekingscellen, glia, en de rode bloedcellen in de pellet. Hoewel de meeste inflammatoire cellen, met inbegrip monocyten, macrofagen, PMN granulocyten en lymfocyten werden gevonden in de pellet, kunnen sommige grote maat-geactiveerde macrofagen zijn te vinden in lagen boven de pellet. De lipide / myeline puin laag (top 7 ml) werd zorgvuldig opgezogen en verwijderd. Cellen werden vervolgens gewassen en geresuspendeerd in 2,5 ml HBSS en gebruikt voor immunokleuring hieronder. 4. Immunokleuring van specifieke immuuncellen voor flowcytometrie Cells (500 ul) zijn verzameld op het ruggenmerg voorbereidingen waren gepelleteerd en geresuspendeerd in 0,85% ammoniumchloride (opgelost in gedestilleerd water) gedurende 5 minuten aan rode bloedcellen lyseren. De cellen werden gewassen met 500 ul HBSS en vervolgens geblokkeerd gedurende 30 minuten in normale konijn of muis serum bij kamertemperatuur. Cellen werden gewassen en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met een antilichaam (konijn anti-PMN FITC, nauwkeurige chemische en Wetenschappelijk, Muis anti-rat ED1 Alexa 488, Serotec, of Muis anti-rat CD3 Alexa 488) of isotype IgG-oplossing verdund in HBSS (alles in een 1:100 verdunning), zoals eerder beschreven: 1. De cellen werden twee keer gewassen na elke stap hierboven en vervolgens geresuspendeerd in 300 ul HBSS na de laatste stap. 5. Cel kwantitatieve beoordeling door flowcytometrie Monsters werden geanalyseerd op een FACS Calibur (Becton-Dickinson) flowcytometer met behulp van Cell Quest-software. 5000 gebeurtenissen per monster werden voorgelezen voor alle monsters, en data-analyse werd aangevuld met Summit (DakoCytomation). Flowcytometrische poorten werden ingesteld met behulp van controle IgG-isotype gelabelde cellen of het ruggenmerg cellen van ongedeerd controle dieren tot de uitgangswaarden voor normalisatie in de tijd punten zoals eerder beschreven een. De gemiddelde waarden van een positieve gelabelde cellen werden uitgedrukt als percentage (± SEM) van het gehele monster. 6. Representatieve resultaten: Het vermogen van een OptiPrep gradiënt aan myeline vuil te verwijderen en te verbeteren immuuncellen detectie door middel van flowcytometrie werd beoordeeld door het kwantificeren van de wervelkolom PMN's bij een dpi (Figuur 1B), de eerder gemelde piek van PMN infiltratie na SCI 1-3. Als alternatief, identiek ontleed ruggenmerg werden enzymatisch gedissocieerd zonder OptiPrep-verwijdering van myeline puin en werden op dezelfde wijze beoordeeld in parallel PMN infiltratie door flowcytometrie. Zoals we al eerder een melding was er een verschuiving in de positie van de gebeurtenissen in monsters geïsoleerd met OptiPrep gradiënt zuivering methode in vergelijking met enzymatische dissociatie alleen, was het aantonen van de percentage van de PMN's gedetecteerd in monsters met intacte myeline puin slechts een fractie (0,5%) van het percentage van de gedetecteerde PMN's (5,1%) in OptiPrep PurifIED monsters (Figuur 1B). Deze gegevens suggereren dat myeline vuil in het weefsel preparaten kunnen flowcytometrische lezingen duister, en laten zien dat het verwijderen van myeline puin verhoogt de gevoeligheid van de immuun cel detectie in de benadeelde ruggenmerg weefsel. Na te hebben vastgesteld de gevoeligheid van het OptiPrep gradiënt systeem voor mobiele detectie in de benadeelde ruggenmerg, we veranderingen in de cellulaire infiltratie kenmerkt zich gedurende een periode variërend van 2 uur tot 180 dpi en richtte een nieuwe multifasische reactie van cellulaire ontsteking na SCI dat PMN's, macrofagen opgenomen / microglia en T-cellen. Zoals wordt bevestigd door eerdere studies 1-3, PMN's eerst in het snoer op 2 uur na het letsel en piekte op een dpi (figuur 2 en 4). Macrofagen / microglia aan de andere kant 1,4,5, werden niet gedetecteerd in de benadeelde ruggenmerg tot 3 dpi, en een hoogtepunt bereikt in eerste instantie op 7 dpi (figuur 3 & 4). Verrassend genoeg, laten we voor de eerste keer dat macrofagen / microglia een piek voor de tweede keer 60 dpi en bleef verhoogd tot 180 dpi (figuur 3 & 4). Vergelijkbaar met macrofagen / microglia, T-cel infiltratie was voorspeld 7 dpi 5-7 piek, maar flowcytometrie had geen veranderingen in de T-cel nummer te detecteren in de eerste 7 dpi, maar een verhoogd aantal T-cellen werd waargenomen op 9 dpi (1,6%) (figuur 4). Terwijl de T-cel nummer was afneemt met 10 dpi, een aanhoudende T-cel respons werd waargenomen door middel van 180 dpi, op dat moment 4,4% van de cellen werden gelabeld voor CD3 (figuur 4). Samen vormen deze gegevens tonen aan een tijdsafhankelijke multifasische reactie van cellulaire ontsteking na SCI (figuur 4); de eerste fasen van de cellulaire ontsteking waren samengesteld uit de vroege piek van PMN's 1 dpi, gevolgd door een piek van ED1 + macrofagen / microglia 7 dpi en T -cellen 9 dpi, terwijl de latere fasen werden samengesteld uit alle drie de cellulaire bevolking stijgt na 14 dpi en aanhoudende via 180 dpi, met een opmerkelijke tweede piek van macrofagen / microglia op 60 dpi. Dit tijdsverloop studie en de kwantitatieve gegevens die zijn gegenereerd door middel van flowcytometrie zijn eerder gevalideerd, waarin vergelijkbare resultaten met gegevens van kwantitatieve stereology van immunolabeled ruggemerg 1. Tabel 1. De voorbereiding van OptiPrep gradiënt voor het verwijderen van myeline puin. Vier OptiPrep gradiënt oplossingen worden gemaakt met behulp van HBSS en verdunde OptiPrep (1:1 verdunning van OptiPrep en MOPS). Figuur 1. OptiPrep helling dichtheden aparte meest myeline / puin van gewonden ruggenmerg weefsels / cellen en immuuncellen beoordeling door flowcytometrie te verbeteren. (A) Myeline / puin werd gescheiden van de cellen (neuronen, glia en immuuncellen) na het centrifugeren van gescheiden ruggenmergweefsel door middel van een OptiPrep gradiënt gevolgd door aspiratie van myeline / puin laag. (B) PMN nummer in de benadeelde ruggenmerg, waaruit verhoogde gevoeligheid bij het opsporen van PMN's na het verwijderen van vuil (Student's t-test, p = 0,0001). Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren; n = 5 per groep, gemiddeld ± SEM. 5000 gebeurtenissen per monster werden voorgelezen voor alle monsters en de gemiddelde waarden van een positieve gelabelde cellen werden uitgedrukt als percentage (± SEM) van het gehele monster. Figuur 2. Detectie van PMN infiltratie in de benadeelde ruggenmerg door flowcytometrie. Na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9, PMN's al snel ging de ruggenmerg vanaf 2 uur (B) na het letsel en een piek een dpi (C). Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren (A). Figuur 3. Detectie van macrofagen / microglia infiltratie in de benadeelde ruggenmerg door flowcytometrie. Na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9, ED1 + macrofaag / microgliale aantal groeide in de benadeelde ruggenmerg vanaf 3 dpi (D), een piek acuut op 7 dpi (E), gedaald naar een laag niveau in 14 dpi (F) , voordat u opstaat en een tweede piek op 60 dpi (G), en bleef in de benadeelde ruggenmerg tot 180 dpi (H). IgG-isotype controle etikettering van 7 dpi spinale cellen (B) lieten een minimale antilichaam-labeling achtergrond en geen verschil antilichaam-gelabelde cellen van twee uur post-gewonden (C) of niet gewond (A) dieren. Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren. Tabel 2. Dier monsters in tijdsverloop experimenten. Voor elk tijdstip (0 uur tot 180 dpi), vijf dieren kregen een matige (200 kd) contusie verwonding op T9,en het ruggenmerg weefsels werden beoordeeld door flow cytometrie voor de nummers van PMN's, ED1 + macrofagen / microglia, en CD3 + T-cellen. Waren echter niet alle dierlijke monsters succes teruggewonnen voor PMN (4-5), ED1 (3-5), en CD3 (4-5) flowcytometrische analyses. Figuur 4. Een tijdsverloop van cellulaire ontsteking in het ruggenmerg na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9. Zoals beoordeeld door middel van flowcytometrie, nummers van PMN's, ED1 + macrofagen / microglia, en CD3 + T-cellen piek acuut (1,7, en 9 dpi, respectievelijk) en hield chronisch in de geblesseerde ruggenmerg. N = 3 tot 5 per groep, gemiddeld ± SEM.