التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية
Summary
معقد الكمي للالتهاب الخلوية في الجهاز العصبي المركزي اصيب / المرضية التي التدفق الخلوي بواسطة دهن / المايلين الحطام يمكن أن يكون لها نفس الحجم والتحبب إلى الخلايا ، وتقليل الحساسية / الدقة. لقد أحرزنا تقدما في طريقة إعداد خلية لإزالة الحطام الميلين وتحسين الكشف عن خلية التدفق الخلوي في النخاع الشوكي المصاب.
Abstract
اكتشاف خلايا مناعية في النظام العصبي المركزي اصيب (CNS) باستخدام تقنيات شكلية أو النسيجي لم تقدم دائما التحليل الكمي الحقيقي للالتهاب الخلوية. التدفق الخلوي هو طريقة بديلة سريعة لتحديد الخلايا المناعية في المخ أو العمود الفقري إصابة أنسجة الحبل السري. تاريخيا ، استخدمت لقياس التدفق الخلوي الخلايا المناعية التي تم جمعها من الدم أو الطحال أو الغدة الصعترية فصلها ، وفقط عدد قليل من الدراسات التي حاولت تحديد الخلايا المناعية في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الطازجة أنسجة الحبل فصلها. ومع ذلك ، يتركز فصل أنسجة الحبل الشوكي مع الحطام الميلين يمكن أن يكون مخطئا لخلايا وتقليل عدد الخلايا الموثوقية التي حصل عليها عداد الكريات التدفق. لقد أحرزنا تقدما في طريقة إعداد الخلية باستخدام نظام التدرج OptiPrep الدهون بشكل فعال على الحطام / الميلين من خلايا منفصلة ، وتوفير quantifications حساسة وموثوق بها من الالتهاب الخلوي في النخاع الشوكي أصيب التدفق الخلوي. كما هو موضح في دراستنا الأخيرة (بيك ونغوين وآخرون ، 2010 فبراير الدماغ ؛ 133 (بط 2) :. 433-47) ، وكان إعداد OptiPrep زيادة حساسية الخلايا للكشف عن الالتهابات الخلوية في الحبل الشوكي المصاب ، مع تهمة أنواع معينة من الخلايا رابطا مع شدة الإصابة. الأهم من ذلك ، شريطة استخدام هذا الأسلوب من رواية توصيف الأولى من الالتهاب الحاد والمزمن الخلوية بعد اصابات النخاع الشوكي لتشمل دوام كامل لكريات الدم البيضاء متعددة النوى (PMNs ، العدلات) ، الضامة / الدبقية الصغيرة ، وخلايا T على مدى فترة تتراوح بين 2 ساعة ل 180 يوما بعد الاصابه (نقطة في البوصة) ، وتحديد المرحلة الثانية من رواية مفاجئة الالتهابات الخلوية. قد توصيف دقيق لالتهاب الخلوية باستخدام هذا الأسلوب توفير فهم أفضل للneuroinflammation في الجهاز العصبي المركزي المصاب ، وتكشف عنصرا هاما من neuroinflammation متعدد الأطوار التي قد تكون حاسمة بالنسبة لتصميم وتنفيذ استراتيجيات عقلانية العلاجية ، بما في ذلك القائمة على الخلية والدوائية التدخلات لاصابات النخاع الشوكي.
Protocol
Discussion
معقد استخدام الخلوي لقياس تدفق الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي بواسطة دهن / المايلين المحتوى والحطام. بالإضافة إلى التدخل في خصوصية والضد ملزمة ، يمكن أن يكون الحطام الميلين حجم وخصائص مشابهة لتحبيب الخلايا المناعية ، وخفض حساسية ودقة قياس 8. طريقة التحضير خلية الرواية الموصوفة هنا هي فعالة في إزالة الأنقاض ويحسن بالتالي الميلين حساسية التدفق الخلوي للكشف عن تغيرات في التهاب الخلوية في الحبل الشوكي المصاب. سمح استخدام هذا الأسلوب الرواية على سبيل المثال ، وإزالة الأنقاض النخاعين هذا الأسلوب الكشف المعززة للخلايا المناعية الأنزيمية مقارنة تفارق alone.Critically ، وتوصيف الأولى من الالتهاب الحاد والمزمن الخلوية بعد اصابات النخاع الشوكي لتشمل دورة زمنية كاملة للPMNs ، حددت الضامة / الدبقية الصغيرة ، وخلايا تي يصل إلى 180 نقطة في البوصة ، والمرحلة الثانية من رواية الالتهابات الخلوية. قد تكون هذه النتائج الهامة مكون من متعدد الأطوار neuroinflammation ستكون حاسمة لتصميم وتنفيذ استراتيجيات عقلانية العلاجية ، بما في ذلك التدخلات سواء خلية القاعدة والدوائية لاصابات النخاع الشوكي.
وقد تم استخدام نظام التدرج OptiPrep على الحطام منفصلة من خلايا الدم في 9 أو تنقية الخلايا العصبية من الدماغ لأغراض الثقافة خلية 10 ، ولكن علينا تعديل هذا النظام وطريقة متقدمة لفصل الحطام الميلين من خلايا النخاع الشوكي فصلها ، وسمح سرعة وأكثر دقة القياس الكمي للالتهاب الخليوي عن التدفق الخلوي. هذا الأسلوب مع التدفق الخلوي من المرجح أن تقدم تقدما ملموسا في مجال البحوث الالتهاب بعد إصابات الجهاز العصبي المركزي أو الحالات المرضية ، حيث أن معظم الدراسات التي تتميز فقط الالتهابات الخلوية في الجهاز العصبي المركزي باستخدام التقنيات الشكلية والنسيجية التي ليست خلية من نوع معين ، أو لا يمكن توفير صحيحا دائما الكمية التقييم. علاوة على ذلك ، وقد حاول عدد قليل من الدراسات الأخيرة لتحديد الخلايا المناعية في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي باستخدام أنسجة جديدة الحبل 11،12 فصلها أو خلايا مفصولة نظام التدرج Percoll 13 ، إلا أن هذه الدراسات أظهرت إما منخفضة أو غلة الخلية حساسة الكشف عن الخلايا المناعية.
في المقابل ، قدمت الخلية التدرج OptiPrep طريقة التحضير لأول مرة ، والتقييم الكمي حساسة وموثوق بها عن طريق التدفق الخلوي للتغيرات الالتهاب الخلوي استجابة لشدة الإصابة ومتدرج على مدى timecourse مدد تصل إلى 180 نقطة في البوصة. حساسية وموثوقية تحليل تدفق cytometric تعتمد أيضا على نوعية الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن أنواع الخلايا المناعية محددة ، والتدفق الخلوي لا تسمح المعايير الشكلية للتمييز مزيد من أنواع الخلايا. تم اختبار الأجسام المضادة لخصوصية ، PMNs الخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة أو T – يخبر جيدا في التدفق الخلوي لPMNs البريتوني والبلاعم السنخية في الثقافة والخلايا في الحبل الشوكي المصاب 1،2 الأنسجة. جنبا إلى جنب مع نظام التدرج OptiPrep ، وقد ساهمت هذه الأجسام المضادة المستخدمة في التدفق الخلوي للجيل من التحليل الكمي والزماني للالتهاب الخلوية التي قدمت رؤية جديدة للديناميات المكروية اصابات النخاع الشوكي ، وحددت للمرة الأولى استجابة موسعة متعدد الأطوار الالتهاب الخلوي. قد يكون هذا رد الفعل المتعدد المراحل من خلايا النخاع الشوكي بعد أن تكون هامة للتحقيق في دور أنواع معينة من الخلايا موجودة في أوقات محددة بعد الإصابة أو توليد التدخلات العلاجية ضد أنواع معينة من الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم الإصابات. وعلاوة على ذلك ، قد تساعد هذه النتائج في وضع الأساس المنطقي المناسب للتدخلات المخدرات أو خلية مقرها الأمثل لاصابات النخاع الشوكي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ريبيكا نيشي ، ماجستير ، ويقوم الفنيون من كريستوفر ودانا ريف مرفق مؤسسة كور الحيوان في جامعة كاليفورنيا في ايرفين لمساعدتهم في جراحة الحيوان. ونحن نشكر أيضا غابرييلا فونيس ، Nekanti أوشا ومورينو Denisse الاستعدادات الفنية لإطلاق النار والمساعدة مخطوطة والفيديو والرسوم المتحركة. وأيد هذا البحث من قبل NINDS (RO1 NS43428 – 01 إلى AJA) ، ومشروع الشلل الأمريكية (PPA – 32574 لHXN) ، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) جائزة الخلية الجذعية تدريب T1 – 00008 لHXN. وأيد KDB بواسطة برنامج التدريب في مجال علوم الأعصاب الخلوية والجزيئية في جامعة كاليفورنيا في ايرفين (T32 NS007444).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 |
| HBSS | Sigma | H1387 |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific | AIFAD51140 |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F |
| Trypsin | Sigma | T9935 |
| Collagenase | Sigma | C5138 |
| DME | Sigma | D1152 |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler’s virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
