Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

1. 기판 준비 외투 계층 실리콘 그런가 자기 adsorbing copoly (DMA – NAS – MAPS) 2 기판 : 공중 합체의 합성, 화학 구조, 및 코팅 과정으로 게시됩니다 : G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero합니다. DNA Microarray 유리 슬라이드에 고분자 Adsorbed 코팅의 특성. 항문. 화학. 2004, 76, 1352년에서 1358년까지. 간단히, deionized (DI) 물 5 ML하는 폴리머의 100 밀리그램을 추가하여 폴리머 솔루션을 준비하고 0.92 M.의 최종 농도에 도달 40 % 포화 암모늄 황산 ((NH 4) 2SO 4) 솔루션의 5 ML을 추가 흔드는 30 분 용액에 그리고 잠수함 칩 디 물로 깨끗이 씻어. 아르곤 / N 2 가스로 완전히 건조. 80 베이크 칩 ° C 15 분. 스토어 폴리머 코팅 최대 3 개월 동안 건조 환경 (진공 건조기)에 기판 / 칩 탐사선이 절차를 야생까지. 2. 항체, 항원, SS / dsDNA, RNA 등 : 프로브 배열의 준비 원하는 버퍼에 적절한 농도 프로브 (S)을 희석. 이 단계는 상당히 다를 수 있지만, 전형적인 실험 산도 ≈ 7.4에서 호수 (PBS)를 버퍼 인산의 0.5 MG / ML의 농도 (0.1 -1 MG / ML 범위)에 항원 또는 IgG을 활용합니다. 이곳은 96 솔루션 – 또는 384 – 글쎄 플레이트 (또는 반점을 찍는 사용을위한 표준 소스 판) 원하는 인쇄 배열 매개 변수를 야생 설정 (시간, 접근 속도 등 머물러) 사용되는 표면 및 솔루션에 적합한 야생 매개 변수를 결정합니다. 그리드, 그리드 레이아웃, 복제 그리드의 번호 및 칩 원하는 야생 위치마다 각각의 조건의 복제의 수를 결정합니다. 플레이스 기판과 적절한 위치에 소스 판은 물론 폐기물 및 공급 병 준비 확인 및 인쇄 실행을 시작합니다. 관찰은 고정 및 해제 과정이 계속 수 있도록 (4~18시간) 높은 습도 환경에서 장소 기판은 밤새 완료되면. 와시 기판 : 0.1 % 트윈 (PBST), PBS, 그리고 마지막으로 deionized (DI) 물을 PBS 세 별도의 세척을위한 3 분 다음과 같은 솔루션에서 그들을 놓으십시오. 실험의 종류에 따라 (서부 유럽 표준시 대 건조), 아르곤 가스로 철저하게 칩을 건조하고 부화를 시작하거나 흐름 챔버에 칩을 넣고 조립. 쉐이크 접시에있는 동안 30 분 동안 7.4로 조정 산도와 ethanolamine 50 MM 솔루션의 칩 잠수함이 잠수하여 공중 합체의 표면에 남아있는 NHS 그룹을 비활성화합니다. 이러한 히드록 실 아민 또는 트리스와 같은 기본 아민 함유 화합물은 또한 오랫동안 준비된 솔루션은 단백질과 함께 사용하는 것이 안전으로 사용할 수 있습니다. 철저히 PBS 다음 DI 워터를 사용하여 해제 솔루션을 씻어. 선택 단계 (고용되는 표면 화학에 따라 다름) : BSA, 카제인의 용액 또는 30 분 rehydrated 우유를 사용하여 블록 표면. 폴리머 백본이 아닌 특정 단백질 바인딩을 방지하기 위해 행위로 우리가 사용하는 현재의 고분자 표면 화학에 대한, 우리는이 단계를 수행하지 마십시오. 3. 데이터 수집과 부화 절차 : 종점 형식 원하는 버퍼에 대한 관심의 대상의 솔루션을 확인하십시오. 여기, 그것은 PBS에 방지 BSA의 적절한 농도 (10 NG / PBS에 방지 BSA의 ML 솔루션 중 1-10 ML을 예)의 솔루션이 될 것입니다. 또한, 대조군 보육에 대한 버퍼의 상당 금액을 (대상 제외)해야 있는지 확인합니다. 모두 이후에 수집된 데이터를 정규화를위한 실리콘 미러 검사를 가져가라. 각 명소의 초기 광학 높이 (질량)을 결정하기 전에 인큐베이션 단계로 IRIS 시스템으로 준비 프로브 배열을 검사합니다. 이것은 표면에 질량의 변화에​​ 적절한 분석을 위해 수, 부화 후, 바인딩의 수준을 즉. 여기 몇 가지 매개 변수가 현재와 같은 노출 시간으로 실험, 시야, prospering 초점 등 조정됩니다 쉐이크 접시에 1 시간 동안 준비 용액에 잠수함 칩 (S). 배양 시간이 상당히 동요의 수준에 따라 달라질 수, 대상의 농도가 감지되고, 흐름 챔버의 전송 특성 (실시간 감지 모드를 사용중인 경우), 대상 – 프로브 쌍 동질성이 등 . 부화 후) 2.5 단계에서 설명한 세척 절차를 반복 IRIS 시스템을 사용하여 동일한 프로브 어레이를 스캔 및 사전 부화 비교 후 부화 이미지를 구하십시오. 보조 항체가 사용되고 샌드위치 분석 형식으로 예를 들어, 필요한 경우 다른 부화 단계에 대해이 과정을 반복합니다. 4. 데이터 분석 프로 연구실 개발한 소프트웨어를 사용, 각 IRIS 스캔 (강도 이미지 시퀀스)에 대한 수집된 이미지 맞추기광학 두께 정보를 포함하는 프로브 어레이의 이미지를 듀스. 바인딩의 빠른 정성 분석 (등록) 게시 및 사전 부화 이미지를 빼서하여 수행할 수 있습니다. 바인딩 대량의 변경이 관찰되었다 반점에서 강도의 변화로 나타납니다. 정량 분석​​을 위해, 현장의 현장과 환대 밖 내의 각 픽셀에 대한 광학 두께 정보를 평균하고이 두 분야의 직접 비교하여 배경에 비해 각 지점의 질량 밀도를 결정한다. 5. 대표 결과 : 그림 1은 대표적인 항체 배열로 발견 계층시 – 그런가 2 IRIS 기판의 예제 설계도를 보여줍니다. 각 항체 앙상블은 다른 단백질을 대상으로 다른 에피토프에 대한 특이성과 복제에서 발견됩니다. 두 개의 다른 모든 바이러스 및 바이러스 단백질은 예를 대상으로 표시됩니다. 대조군 항체는 분석에 따라이 아닌 특정 및 / 또는 바이러스 특정 수 있습니다. 그림 2는 (HSA) 인간 혈청 알부민의 바인딩을 보여줍니다 특정 발견 HSA와 토끼 IgG (제어) 명소의 배열에 항체. 여기로 본, 광학의 조립과 결정 후 사전 및 사후 부화 이미지 두께, 바인딩 배열의 차이 이미지는 질적으로 평가하기 위해 바인딩을 만들 수 있습니다. 정량 분석​​은 2.05와 0.13 나노미터는 광학 높이 변경 500 NG / ML의 방지 HSA 부화 농도에 대한 각각의 HSA와 토끼 IgG 명소에 대한 관찰 있었다는 것을 보여줍니다. 그림 3은 단백질 농도 및 dsDNA의 올리고머의 길이에 모피 단백질 바인딩 의존의 IRIS 측정을 보여줍니다. 상단 그래프는 초기 고정 올리고머 프로브 헤이츠 및 사후 배양 펄 바인딩에 대한 절대 광학 높이 측정을 보여줍니다. 모피의 증가 농도 (50, 100, 200 NM)은 DNA 프로브로 증가 바인딩 결과. oligomers의 길이도 더 바인딩의 결과로 더 이상 시퀀스와 펄 바인딩을 영향을 미칩니다. 여기, 오차 막대는 뜻에서 한 표준 편차를 나타냅니다. 하단 줄거리는 dsDNA 스트랜드 당 바인딩 계산 펄 단백질 이합체를 보여줍니다. 이합체 구속력이 크게되지 않은 특정 바인딩의 높은 수준을 제안 200 NM의 모피 단백질 농도에서 증가했다. 그림 1. 일반적으로 IRIS 시스템을 갖춘 멀티 플렉스 방식으로 특정 바이러스 및 바이러스 구성 요소를 감지하는 실험에 사용되는 예제 프로브 배열의 도식. 그림 2. 목격 HSA에 인간 혈청 알부민 특정 항체의 바인딩을위한 포스트 인큐베이션 차이 이미지 500 NG / ML의 농도에서이 레이블이없는 시스템을 수집했습니다. 각 장소에 대한 biomaterial 질량 밀도가 자리 이내 광학 두께 정보를 평균하고 배경을 나타내는 지점 주위에 고리의 평균이 비교에 의해 결정됩니다. 그림 3. 올리고머의 길이, 올리고머 이내에 합의 순서의 위치, 그리고 펄 단백질 농도를 기반으로 알려진 합의 순서와 발견 더블 좌초 oligomers로 펄 단백질 상호 작용에 대한 데이터 바인딩의 플롯. 각 발견 순서 (상단)에 바운드 모피 단백질의 절대 금액에 대한 정보는 올리고머 (하단)의 각 유형에 바운드 모피 dimers의 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.