Использование флуоресцентных Иммуно-химия для обнаружения Edwardsiella ictaluri В канале сома ( I. punctatus) Образцов
Summary
Здесь мы опишем процедуру, позволяющую маркировки<em> Edwardsiella ictaluri на месте</em> В гистологических срезов с канала сома<em> Ictalurus punctatus</em> С использованием косвенных иммуногистохимии с моноклональными антителами Ed9 как первичного, и флуоресцентные FITC меченых антител в качестве вторичного. Это позволило обнаружения бактерии помощью флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Хотя Edwardsiella ictaluri является основным возбудителем канал сома Ictalurus punctatus и было обнаружено почти три десятилетия назад 1,2, до сих пор, насколько знания этих авторов, не метод был разработан для обеспечения на месте визуализации бактерии в гистологических срезов.
Хотя бактериальный локализация была определена в естественных условиях и в предыдущих исследованиях с использованием пластин насчитывает 3, радиометрические помечены 4 или биолюминесценции бактерий 5, большинство из этих исследований были только осуществляется на грубом уровне органа, за одним исключением 6. Это ограничение имеет особое беспокойство, потому что E. ictaluri имеет сложный цикл инфекции 1,7, и она имеет целый ряд факторов вирулентности 8,9. Сложного взаимодействия E. ictaluri со своим хост во многом сходны с сальмонеллы брюшного тифа 10, который находится в той же семье таксономических.
Здесь мы опишем метод позволяет для обнаружения бактерий с использованием косвенных иммуно-гистохимии использованием моноклональных антител Ed9 описывается Эйнсворт и соавт. 11.
Коротко, блокирование сыворотки наносят на парафин гистологических срезов для предотвращения неспецифического выжидал. Затем, разделы инкубировали с первичными антителами: Е. ictaluri специфических моноклональных антител Ed9. Превышение антитела смыть и FITC меченых вторичных антител добавлены. После полоскания, разделы монтируются с люминесцентными конкретные установки среды.
Это позволило обнаружения E. ictaluri на месте в гистологических срезов тканей канал сома.
Protocol
Discussion
Этот протокол подробностей методики на месте визуализации сома возбудителя Edwardsiella ictaluri в гистологических срезов. Насколько нам известно, это первый такой протокол, описанный.
Наиболее важным шагом, по нашему опыту, является полоскание антител, как описано в ш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, технической помощи Бэйнс Мишель, а также доктор Петра-Хансона, доктор Eels и Тимоти Браун за помощь разработке и осуществлении иммуногистохимии. Этот проект был профинансирован Министерством сельского хозяйства США КРИС проект № MISV-0801310 и Университета штата Миссисипи колледжа ветеринарной медицины.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
