השימוש פלורסנט חיסונית-לכימיה לצורך זיהוי של Edwardsiella ictaluri ב שפמנון ערוץ ( א punctatus) דגימות
Summary
כאן אנו מתארים את הליך המאפשר תיוג<em> Edwardsiella ictaluri באתרו</em> בסעיפים היסטולוגית של שפמנון ערוץ<em> Ictalurus punctatus</em> באמצעות אימונוהיסטוכימיה עקיף עם נוגדנים חד שבטיים Ed9 כמו נוגדנים הראשוני, פלורסנט שכותרתו FitC כמו משנית. זה איפשר זיהוי של החיידק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
בעוד Edwardsiella ictaluri הוא הפתוגן העיקרי של שפמנון ערוץ Ictalurus punctatus כבר גילו כמעט שלושה עשורים לפני 1,2, עד כה, לפי מיטב הידע של הסופרים האלה, השיטה לא פותחה כדי לאפשר ב להדמיה מקומית של חיידקים בסעיפים היסטולוגית.
בעוד לוקליזציה חיידקי נקבע in vivo במחקרים קודמים באמצעות ספירת צלחת 3, 4 שכותרתו רדיומטרי, או חיידקים bioluminescent 5, רוב המחקרים בוצעו רק ברמה איבר ברוטו, עם חריג אחד 6. הגבלה זו מדאיג במיוחד כי א ictaluri יש מחזור זיהום 1,7 מורכבות, ויש לה מגוון גורמים ארסיות 8,9. האינטראקציה המורכבת של E. ictaluri עם המארח שלו הוא דומה במובנים רבים Salmonella typhi 10, אשר בתוך המשפחה הטקסונומית.
כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת זיהוי של חיידקים באמצעות עקיפה חיסונית histochemistry באמצעות נוגדן חד שבטי Ed9 שתואר על ידי Ainsworth et al. 11.
בקצרה, סרום חסימת מוחל בסעיפים פרפין מוטבע היסטולוגית כדי למנוע הלא ספציפית ממתין. ואז, הסעיפים מודגרת עם הנוגדן עיקריים: א ictaluri נוגדן חד שבטי ספציפי Ed9. נוגדנים הם עודף ושטף ממנו את הנוגדנים FitC משני שכותרתו מתווספים. לאחר השטיפה, הקטעים הם רכובים עם פלורסנט בינוני הרכבה ספציפיות.
זה איפשר זיהוי של E. ictaluri באתרו בסעיפים היסטולוגית של הרקמות שפמנון הערוץ.
Protocol
Discussion
זה פרוטוקול פרטים טכניקה של הדמיית באתרו של הפתוגן שפמנון Edwardsiella ictaluri בסעיפים היסטולוגית. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול כזה הראשון שתיאר.
השלב הקריטי ביותר, שעל פי ניסיוננו, היא שטיפה של נוגדנים כפי שמתואר בשלב 4.4 של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להכיר סיוע טכני של הקללות מישל וכן ד"ר פטרי, הנסון, צלופחים ד"ר טימותי בראון על עזרתם בפיתוח וביצוע אימונוהיסטוכימיה. פרויקט זה מומן על ידי משרד החקלאות Cris הפרויקט # MISV-0801310 ועל ידי מדינת מיסיסיפי מאוניברסיטת קולג' לרפואה וטרינרית.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
