Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van Edwardsiella ictaluri In kanaal meerval ( I. punctatus) Monsters
Summary
Hier beschrijven we een procedure om de etikettering van<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> In histologische secties van kanaal meerval<em> Ictalurus punctatus</em> Met behulp van indirecte immunohistochemie met monoklonale antilichamen Ed9 als een primaire, en fluorescerende FITC gelabelde antilichamen als een secundaire. Dit toegestaan voor de detectie van de bacterie met behulp van fluorescentie microscopie.
Abstract
Terwijl Edwardsiella ictaluri is een belangrijke ziekteverwekker van kanaal meerval Ictalurus punctatus en heeft ontdekt bijna drie decennia geleden 1,2, tot nu toe, om de beste van deze auteurs de kennis, is geen methode ontwikkeld om voor het laten in situ visualisatie van de bacteriën in histologische secties.
Terwijl de bacteriële lokalisatie is vastgesteld in vivo in eerdere studies met plaattellingen 3, radiometrische gelabeld 4 of 5 bioluminescente bacteriën, zijn de meeste van deze studies is alleen uitgevoerd op de bruto-orgel niveau, met een uitzondering 6. Deze beperking is van bijzonder belang, omdat E. ictaluri heeft een complexe infectie cyclus 1,7, en het heeft een aantal virulentiefactoren 8,9. De complexe interactie van E. ictaluri met zijn gastheer is in veel opzichten vergelijkbaar met Salmonella typhi 10, die in dezelfde taxonomische familie.
Hier beschrijven we een techniek waardoor de detectie van bacteriën met behulp van indirecte immuno-histochemie met behulp van het monoklonale antilichaam Ed9 beschreven door Ainsworth et al.. 11.
In het kort, is een blokkerende serum toegepast op paraffine ingebedde histologische secties van niet-specifieke afwachtende voorkomen. Vervolgens worden de secties geïncubeerd met het primaire antilichaam: E. ictaluri specifieke monoklonale antilichaam Ed9. Overtollige antilichamen zijn weggespoeld en de FITC gemerkte secundaire antilichamen worden toegevoegd. Na het spoelen, zijn de secties gemonteerd met een fluorescerende specifieke montage-medium.
Dit toegestaan voor de detectie van E. ictaluri in situ in histologische secties van het kanaal meerval weefsels.
Protocol
Discussion
Dit protocol details een techniek voor de in situ visualisatie van de meerval pathogeen Edwardsiella ictaluri in histologische secties. Om het beste van onze kennis, is dit de eerste beschreven dergelijk protocol.
De meest kritische stap, in onze ervaring, is het spoelen van de antilichamen zoals beschreven in de stap 4.4 van het huidige protocol, omdat onvoldoende wassen kan leiden tot valse positieve.
Het grootste probleem met het interpretere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de technische bijstand van Michelle Banes evenals dr. Petrie-Hanson, Dr Alen en Timothy Brown herkennen voor hun hulp het ontwikkelen en uitvoeren van de immunohistochemie. Dit project werd gefinancierd door USDA CRIS project # MISV-0801310 en door de Mississippi State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
