ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

DNA microarrays têm emergido como uma poderosa ferramenta para a detecção de patógenos. ^1-5 Por exemplo, muitos exemplos da capacidade de tipo e subtipo do vírus influenza tem sido demonstrado. ^6-11 A identificação e subtipos de gripe em microarrays de DNA tem aplicações tanto em público saúde e da clínica para a detecção precoce, intervenção rápida, e minimizar o impacto de uma pandemia de influenza. Fluorescência tradicional é atualmente o método de detecção mais comumente utilizados microarray. No entanto, como tecnologia de microarray progride para uso clínico, ^uma substituindo a instrumentação caros com tecnologia de detecção de baixo custo que apresentem características de desempenho semelhante ao de fluorescência fará ensaios de microarray mais atrativo e rentável.

A tecnologia de detecção colorimétrica ampliPHOX é destinado a aplicações de pesquisa, e tem um limite de detecção dentro de uma ordem de magnitude da fluorescência tradicionais ^11, com uma vantagem principal é um valor aproximado de dez vezes menor custo em comparação com o instrumento scanners microarray confocal de fluorescência necessários para microarray detecção. Outra vantagem é o tamanho compacto do instrumento que permite a portabilidade e flexibilidade, ao contrário dos tradicionais instrumentos de fluorescência. Porque a tecnologia de polimerização não é tão linear como inerentemente detecção de fluorescência, no entanto, é mais adequado para aplicações de menor densidade microarray em que um sim / não respondeu para a presença de uma determinada seqüência é desejada, como, por matrizes de detecção de patógenos. Atualmente a densidade local máxima compatível com a detecção ampliPHOX é de aproximadamente 1.800 pontos / matriz. Devido às limitações de densidade local, microarrays maior densidade não são adequados para a detecção ampliPHOX.

Aqui, apresentamos ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica como um método de amplificação de sinal em um microarray de baixa densidade desenvolvido para a detecção e caracterização dos vírus influenza (FluChip). Embora este protocolo utiliza o FluChip (um microarray de DNA) como uma aplicação específica do ampliPHOX detecção, qualquer microarray incorporando-alvo biotinilado pode ser rotulada e detectado de forma similar. O projeto microarray e Biotinilação do alvo a ser capturada são de responsabilidade do usuário. Uma vez que o alvo biotinilado foi capturado na matriz, detecção ampliPHOX pode ser realizada por marcação a primeira matriz com um conjugado de estreptavidina-label (ampliTAG). Após a exposição à luz usando o instrumento ampliPHOX Leitor de polimerização, de uma solução de monômero (ampliPHY) ocorre somente em regiões contendo ampliTAG marcado alvos. O polímero formado pode ser posteriormente coradas com uma solução não tóxica para melhorar o contraste visual, seguido de imagem e análise usando um pacote de software simples (ampliVIEW). O ensaio FluChip inteira de un-extraído de amostra para resultado pode ser realizado em cerca de 6 horas, e as etapas de detecção de ampliPHOX descrito acima pode ser concluído em cerca de 30 min.