ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza
Summary
ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.
Abstract
DNA microarrays hebben zich ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor het opsporen van ziekteverwekkers. 1-5 bijvoorbeeld, vele voorbeelden van het vermogen om te type en subtype influenza virus zijn aangetoond. 6-11 De identificatie en subtypering van influenza op DNA microarrays heeft toepassingen in zowel de publieke gezondheid en de kliniek voor vroege opsporing, snelle interventie, en het minimaliseren van de impact van een grieppandemie. Traditionele fluorescentie is momenteel de meest gebruikte micro-array detectie methode. Echter, zoals microarray technologie voortschrijdt naar klinisch gebruik, een te vervangen dure instrumenten met een lage cost detectie technologie vertonen vergelijkbare prestaties kenmerken fluorescentie zal microarray testen aantrekkelijker en kosten-effectief is.
De ampliPHOX colorimetrische detectie technologie is bestemd voor onderzoek-toepassingen en heeft een detectiegrens binnen een orde van grootte van de traditionele fluorescentie 11, met een groot voordeel dat een ongeveer tien maal lager instrument kosten in vergelijking met de confocale microarray scanners die nodig zijn voor fluorescentie microarray detectie. Een ander voordeel is de compacte afmetingen van het instrument die het mogelijk maakt voor draagbaarheid en flexibiliteit, in tegenstelling tot traditionele fluorescentie-instrumenten. Omdat de polymerisatie-technologie is niet zo lineair als inherent fluorescentie detectie, echter, is het meest geschikt voor een lagere dichtheid microarray toepassingen waarbij een ja / nee antwoord op de aanwezigheid van een bepaalde volgorde gewenst is, zoals voor het opsporen van ziekteverwekkers arrays. Momenteel is de maximale dichtheid plek compatibel is met ampliPHOX detectie is ~ 1800 plekken / array. Omwille van de plek dichtheid van beperkingen, hogere dichtheid microarrays zijn niet geschikt voor ampliPHOX detectie.
Hier presenteren wij ampliPHOX colorimetrische detectie technologie als een methode van signaalversterking op een lage dichtheid microarray ontwikkeld voor de detectie en karakterisering van influenza virussen (FluChip). Hoewel dit protocol maakt gebruik van het FluChip (een DNA microarray) als een specifieke toepassing van ampliPHOX detectie, een microarray te nemen gebiotinyleerd doel kan worden geëtiketteerd en ontdekt in een vergelijkbare manier. De microarray ontwerp en biotinylatie van het doel vast te leggen onder de verantwoordelijkheid van de gebruiker. Zodra de gebiotinyleerde doelstelling is vastgelegd op de array, kan ampliPHOX detectie worden uitgevoerd door eerst het coderen van de array met een streptavidine-label conjugaat (ampliTAG). Bij blootstelling aan licht met behulp van de ampliPHOX Reader instrument, polymerisatie van een monomeer oplossing (ampliPHY) komt alleen voor in gebieden met ampliTAG-gelabeld doelen. De gevormde polymeer kan vervolgens worden gekleurd met een niet-giftige oplossing voor visueel contrast te verbeteren, gevolgd door beeldvorming en analyse met behulp van een eenvoudige software-pakket (ampliVIEW). De gehele FluChip test van de VN-geëxtraheerde monster resultaat kan worden uitgevoerd in ongeveer 6 uur, en de ampliPHOX detectie hierboven beschreven stappen kunnen worden ingevuld in ongeveer 30 minuten.
Protocol
Discussion
De ampliPHOX colorimetrische detectie technologie hier wordt gepresenteerd is een snel, goedkoop alternatief voor een kleur fluorescentie detectie voor een lagere dichtheid microarray-toepassingen. Schematisch weergegeven in figuur 1, is de detectie principe gebaseerd op het gebruik van een foto-initiator label (1B). In de aanwezigheid van een monomeer-bevattende oplossing (1C), blootstelling aan licht zorgt ervoor dat de foto-initiator (ampliTAG) op gang te brengen een polymerisatiereactie alleen in he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR erkent NIH / NIAID U01AI070276 en R43AI077112 voor de financiering van dit werk.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
