Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

1. Isolamento de células CD4 + T-Humanos Células do sangue periférico (ver Figura 1) Sangue venoso periférico (40 a 60 ml) é coletado em Vacutainer Tubos contendo heparina sódica (Becton Dickinson). O sangue periférico é então transferida do Vacutainer Tubos para tubos de 50 ml poliestireno cônica (20 mL de sangue por tubo). RosetteSep CD4 + T-Cell reagente de isolamento (StemCell Technologies) é adicionado em um volume de 1 mL a não mais de 20 mL de sangue em um tubo de 50 ml e misturar bem. A mistura é então incubadas a 20-25 ° C por 20 minutos. Após 20 minutos, cálcio e magnésio-free (CMF) tampão fosfato [PBS (HyClone] w / 2% inativado pelo calor (56 ° C por 30 minutos) de soro fetal bovino [FBS (HyClone)] é adicionado à mistura a fim de atingir um volume final de 40 mL. As misturas diluídas (30 ml) são, então, camadas em cima de 15 mL de meio de separação de Linfócitos [LSM (Cellgro)] em fresco tubos de poliestireno 50 mL cônico. Os tubos de 50 ml são, então, centrifugadas a 1200 x g por 20 minutos com o freio. Os 50 mL tubos são removidos da centrífuga cuidadosamente, de modo que a interface entre o LSM e médias empresas não é perturbado. As células na interface são coletados com uma pipeta 10 mL e colocados em tubos de poliestireno fresco 50 ml. As interfaces coletados são diluídos com PBS FBS w / 2% para um volume final de 50 mL. Os 50 tubos contendo as interfaces mL diluídos são centrifugadas a 1200 x g por 10 minutos com o freio. Após a centrifugação, os sobrenadantes são aspirados e os sedimentos ressuspensos em 10 mL de PBS w / FBS 2%. As suspensões de células são então combinados em um único tubo cônico de 50 mL e diluído para 50 ml com PBS w / FBS 2%. O tubo contendo a suspensão celular combinado é centrifugado a 300 x g por 10 minutos para remover todos os restantes LSM. O sobrenadante é aspirado eo pellet é então ressuspendido em 10 mL de RPMI-1640 meio (HyClone) contendo 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mcg / ml de estreptomicina (HyClone) e 2 mM L-glutamina (CellGro ) (RPMI-completo) e contou com um hemocitômetro. A concentração de purificada CD4 + T-Cells é então ajustado para 3×10 6 mL / com RPMI-completo. CD4 + 's são, então, estimulado pela cultura deles com anti-CD3/anti-CD28 acoplado a contas [T-Cell Kit de Expansão (Miltenyi Biotec)] em três contas por razão entre células por 72 horas a 37 ° C em 5% C0 2 umidificado incubadora. 2. Infecção de células CD4 + T-Cells com HIV-1 (ver Figura 1) Suspensão de células contendo CD4 + T-estimulou as células são retiradas da placa de cultura e contou com um hemocitômetro. CD4 + T-cells (~ 2×10 6) são adicionados a um tubo de 15 mL cônico para uso como um controle não infectado. O restante do CD4 + células T suspensão é colocada em um tubo cônico de 50 mL para a infecção. Os tubos contendo as células CD4 + T células suspensões são centrifugadas a 300 x g por 10 minutos eo sobrenadante de cultura é aspirado. CD4 + T-estimulado células são ressuspendidas diretamente em fluidos de cultura contendo virions e spin-infectados em 1200 x g por 2 horas a 20-25 ° C 9. Normalmente nós infectar células CD4 + T-células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 para uma estirpe de replicação do HIV deficiente (por exemplo, DHIV-3) ou um MOI de 0,01 para um vírus de replicação competente (por exemplo, o HIV-1 NL4 / 3) . Volume final não é importante, mas os tubos devem ser equilibradas para centrifugação. Polibrene (Santa Cruz) é adicionado ao líquido cultura antes spinfection numa concentração final de 10 mcg / ml. Após a conclusão do spinfection, sobrenadantes são removidos e as células ressuspensas em uma densidade celular de 3×10 6 mL / em RPMI-completo suplementado com 100 U / mL IL-2. As células infectadas e não infectadas são a cultura por 72 horas, se um vírus de replicação incompetente foi usado para infectar a célula ou 5-7 dias se um vírus de replicação competente foi usado para infectar as células. Mídia deve ser trocado a cada 48 horas durante a cultura. 3. Isolamento de células Natural Killer do sangue periférico Sangue venoso periférico (~ 100 ml) é coletada do mesmo doador usado para isolar as células CD4 + T-cells em Vacutainer Tubos contendo heparina sódica (Becton Dickinson). O sangue é então transferida do Vacutainer Tubos de 50 mL em tubos cônicos de 20 mL alíquotas. O Vacutainer Tubos são então lavados com 8 mL de solução de sal CMF Hanks equilibrado [HBSS (Hyclone)] e as lavagens são transferidos para a 50 mL conicals containing a 20 mL de sangue periférico. O volume resultante em cada 50 ml é de 35 mL. O sangue é então diluída em camadas em cima de 15 mL de LSM em um novo tubo cônico de 50 mL e os tubos centrifugados a 400 x g por 30 minutos com o freio. Os tubos foram cuidadosamente retirados da centrífuga ea interface resultante entre o LSM e médias empresas é colhido de cada tubo usando uma pipeta 10 mL e colocada em novos tubos cônicos de 50 mL. As suspensões de células são lavadas uma vez com CMF HBSS (centrifugado a 400 x g por 15 minutos com o freio). Após a primeira lavagem os sobrenadantes foram removidos e os pellets resultantes são combinados em um único de 50 mL cônica e lavadas duas vezes com HBSS CMF (centrifugado a 30 x g por 10 minutos com o freio) para remover todos os restantes LSM. Após a última lavagem do pellet é resupended em 10 mL de tampão de lise ACK (150 mM NH 4 Cl, 1,0 mM KHCO 3 e 0,1 mM EDTA pH 7,3) e incubados à temperatura ambiente (20-25 ° C) por 5 minutos. Esta etapa é necessária a fim de eliminar os eritrócitos contaminantes a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Depois de 10 minutos. 40 mL de PBS CMF é adicionado à suspensão de células, a fim de parar a reação de lise. O tubo com a suspensão de células contendo os eritrócitos lisados ​​PBMC e é então centrifugado a 300 x g por 10 minutos com o freio. O sobrenadante é removido eo pellet ressuspenso é em 5 mL de PBS com 2% de SFB e mM EDTA 2 e contou com um hemocitômetro. O natural killer (NK) são então isolados do PBMC usando um Kit de isolamento celular NK [seleção-humano negativo (Miltenyi Biotec)] de acordo com as instruções dos fabricantes. O fluxo através das colunas são coletados em tubos de 15ml e os tubos são centrifugados a 300 x g por 10 minutos com o freio. Os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos ressuspensos. Os sedimentos ressuspensos são combinados em um tubo em um volume total de 1 mL de meio modificado Iscove de Dulbecco [IMDM (Gibco)] suplementado com 10% AB + inactivado pelo calor (56 ° C por 30 minutos) soro humano (SH) e contou com uma hemocitômetro. O volume de suspensão de células é ajustado com IMDM HS w/10% de modo que a densidade final das células NK é 3×10 6 / mL. A suspensão de células é dividido ao meio. Um conjunto de células NK recebe 200 U / mL de recombinante humana interleucina-2. O outro conjunto de células é deixado no meio, sem tratamento de citocinas. As culturas de células NK são então incubadas overnight a 37 ° CO C, 5% 2 As células resultantes NK são então usadas como células efetoras para qualquer ensaio de desgranulação um ou CD107a ensaio de liberação de 51 Cr. 4. Purificação do HIV-1 células infectadas (ver Figura 1) Os fluidos de cultura contendo células infectadas são removidas das placas e centrifugado a 300 x g por 10 minutos com o freio. O sobrenadante é aspirado e as pelotas são ressuspendidos em 2 mL de PBS com 2% de SFB e mM 2 EDTA e células contadas em um hemocitômetro. Células infectadas que não contêm HIV-1 são isolados longe os que abrigam o vírus, aproveitando o fato de que o HIV-1 modula baixo CD4. Para esta finalidade CD4 Kit de isolamento Positivo (Invitrogen) é usado de acordo com as instruções dos fabricantes com a ressalva de que um a-CD4 talão por razão de celular é utilizado. Após a remoção das células CD4 + T-cells, as células mortas são removidas da população de células purificadas abrigar o vírus usando um Kit Remoção Morto Cell (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções dos fabricantes. O fluxo através após a remoção de células mortas em colunas é centrifugado a 300 x g por 10 minutos com o freio. O sobrenadante é removido, pellets ressuspenso em 1 mL RPMI completo e as células são contadas. As células purificadas infectados estão agora prontos para uso como alvos em um ensaio de desgranulação CD107a ou 51 ensaio de liberação de Cr. 5. CD107a Degranulação Assay (ver figura 2) Culturas de células NK são removidos a partir de chapas e da suspensão de células é contado. Suspensões de células NK são centrifugadas a 300 x g por 10 minutos com o freio. As células NK são suspensas em RPMI-completo ea concentração final ajustada para 10 6 células / mL. Suspensões de células do isolado infectadas e não infectadas as células T geradas nas etapas acima são centrifugadas a 300 x g por 10 minutos com o freio. Sobrenadantes são removidos e sedimentos ressuspensos em RPMI-completo em 2×10 6 células / mL. K562 células são usadas como células-alvo no controlo positivo, como eles são altamente suscetíveis à lise NK. Tele células são centrifugadas a 300 x g por 10 minutos com o freio, sobrenadantes são removidos e sedimentos ressuspensos em RPMI-completo em 2×10 6 células / mL Em uma 96-v-100 placa bem fundo mcL de alvos e 100 effectors mcL são adicionados aos poços. Um poço com 100 e 100 effectors mcLof mcL de meio sem células-alvo será usado para não-específicas degranulação das células NK. A cada poço 10 mcLFITC conjugado anti-CD107a (BDIs) é adicionado. A placa é então centrifugado a 20 x g por 2 minutos com o freio. A placa de centrifugado é incubada por 4 horas a 37 ° C e 5% CO 2. Após a incubação a placa é centrifugado a 400 x g por 5 minutos com o freio. O sobrenadante é removido o sedimento. Cada poço é então coradas com o painel seguinte do fluorocromo-anticorpos em gelo por 20 minutos em um total de 100 buffer de fluxo mcLof (PBS w / 2% de SFB e 0,1% NaN 3) anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-conjugado (Biolegend)] anti-CD56 [APC (Biolegend)] Após a incubação de 20 minutos, 200 mcL de tampão de fluxo é adicionado a cada poço ea placa é centrifugado a 400 x g por 5 minutos com o freio. O buffer de fluxo é então cuidadosamente aspirados de cada poço usando uma pipeta 2 mL aspiração equipado com uma ponta de micropipeta 200 mcL assegurando ao mesmo tempo não perturbar o sedimento. Etapa 15 e 16 são repetidos mais uma vez. Pelotas são ressuspenso em 200 mcL de paraformaldeído 1% em PBS CMF. As suspensões de células são então transferidos para tubos de fluxo. Volume total é trazido até 300 mcL adicionando ~ 100 mcL de paraformaldeído 1% em CMF PBS a cada tubo. Os eventos (2×10 4) correspondentes às células NK são coletados por um citômetro de fluxo FACS usando a DIVA (BDIs) software para aquisição e analisados ​​utilizando Fluxo Jo software (TreeStar). 6. CD107a Estratégia Gating (ver Figura 3) Portões única célula são criadas usando uma altura de dispersão para a frente (FSC-H) vs largura dispersão para a frente (FSC-W) enredo. Para trama tamanho versus granulosidade uma dispersão lateral FSC vs plot (SSC) é criado no portão única célula. Geralmente os linfócitos têm granularidade relativamente baixo e tamanho da célula média. As células do gate de linfócitos são então plotados em um gráfico de pontos de CD3/14/20 células coradas vs CD56 de células marcadas para a porta das células NK, enquanto omitindo monócitos (CD14), as células T (CD3) e células B ( CD20). O CD56 população pos gated é então avaliado para CD107a. As células NK, sem grupo de alvos é usado para definir as portas para o que é considerado CD107a negativo. 7. 51 ensaio de liberação de Cr (ver Figura 4) Células-alvo infectadas são rotulados com 125 MCCI 51 Cr (Perkin Elmer) em saline/10 6 células durante 2 horas em um total de 500 mcL a 37 ° C e 5% CO 2. Como controle positivo 10 6 células K562 são rotulados com 100 MCCI 51 Cr durante 2 horas em um total de 500 mcL a 37 ° C e 5% CO 2. O volume total é trazido até 500 mcL com RPMI-completo. O volume de 51 Cr adicionados às células-alvo é calculado aqui: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) Enquanto as células-alvo são rotulagem, previamente isoladas células NK são removidas da cultura e contadas. Culturas de células contendo as células NK são centrifugadas a 300 x g por 10 minutos com os freios. Pellets contendo células NK são suspensas em RPMI-completo e dividido em três tubos. A densidade celular é ajustada para 10 5 mL / em um tubo, 2.5×10 5 ml / no segundo tubo e 5×10 5 mL / no tubo de terceiros. Células marcadas alvos são retirados da incubadora e 4,5 mL de RPMI-completo é adicionado a cada tubo. Tubos são, então, centrifugado a 300 x gf ou 10 minutos. Sobrenadante é decantado cuidadosamente a não perturbar o pellet em um recipiente para resíduos líquidos radioactivos. Os passos 4 e 5 são repetidas mais duas vezes para remover todos os inabsorvível 51 Cr. Sobrenadantes da terceira lavagem podem ser eliminados de um recipiente para resíduos não radioactivos líquidos. Alvos são rotulados então ressuspendido em RPMI-completo para uma densidade celular final de 10 de 5 mL /. 100 mcL de alvos marcados são extraídos dos poços de uma placa de 96-v-bottom bem para um número de celular final de 10 4 células / target bem. Tabela 1 é um exemplo de uma configuração típica para um ensaio de liberação de 51 Cr. Cada grupo é feita em triplicado. 1 2 <td> 3 4 5 6 7 8 9 A K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) B UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) C HIV-1 E Infected: T (1:1) HIV-1 E Infected: T (1:1) HIV-1 E Infected: T (1:1) HIV-1 E Infectados: T (2,5:1) HIV-1 E Infectados: T (2,5:1) HIV-1 E Infectados: T (2,5:1) HIV-1 E Infected: T (1:1) HIV-1 E Infected: T (1:1) HIV-1 E Infected: T (1:1) D E F K562 liberação espontânea K562 liberação espontânea K562 liberação espontânea UI liberação espontânea UI liberação espontânea UI liberação espontânea HIV-1 de Lançamento Infected espontânea HIV-1 de Lançamento Infected espontânea HIV-1 de Lançamento Infected espontânea G K562 Lançamento máxima K562 Lançamento máxima K562 Lançamento máxima UI Lançamento máxima UI Lançamento máxima UI Lançamento máxima HIV-1 de Lançamento Maxmum Infected HIV-1 de Lançamento Maxmum Infected HIV-1 de Lançamento Maxmum Infected 100 mcL do acima suspensões de células NK são adicionados a cada poço contendo células-alvo. 100 mcL de alvos são adicionados aos poços correspondentes em que as células efetoras estão ausentes para os grupos de liberação máxima e espontânea. O grupo liberação espontânea é incubada com um adicional de 100 mcL de RPMI-completo. A placa de 96 poços é centrifugado a 20 x g por 2 minutos com o freio. A placa é então centrifugado incubados a 37 ° C e 5% CO 2 por 4 horas. Após a 4 horas de incubação 5 mcL de uma diluição de 1:10 de células vermelhas do sangue em RPMI-completo é adicionado a cada poço, exceto os poços liberação máxima. 100 mcL de sulfato de sódio dodecil 10% é adicionado aos poços liberação máxima. A placa é centrifugado a 400 x g por 5 minutos para sedimentar as células. 100 mcL de célula-livre sobrenadante é colhido de cada bem e colocado em separado gamma-counter tubos (Perkin Elmer). Os tubos são colocados em um contador gama 2470 automático (Perkin Elmer). A quantidade de actuais 51 Cr no fluido cultura é medido como contagens por minuto a partir da média de uma leitura de 2 minutos. Contagens por minuto (CPM) leituras das amostras e controles são usados ​​para calcular a lise% específico usando a seguinte equação: [(CPM experimental – média de CPM espontânea) / (média de CPM máximo – média CPM espontânea)] x 100 8. Resultados representativos: Figura 1. Etapas envolvidas no isolamento de células natural killer ea geração de HIV-1 as células-alvo infectadas a partir do sangue periférico. Figura 2. Etapas envolvidas na construção de um ensaio de desgranulação CD107a utilizando células NK como efetores e células K562, CD4 + não infectadas e células T infectadas pelo HIV-1 células T como alvos. Figura 3. Estratégia de citometria de fluxo gating para um ensaio de desgranulação CD107a. (A) Gating em células isoladas e aglomerados excluindo ou doublets em um terreno de FSC-A (área de dispersão para a frente) vs FSC-H (altura dispersão para a frente). (B) porta celular único plotados como FSC vs A-gating SSC (Side Scatter) na população de linfócitos. (C) linfócitos plotados como CD3/14/20(Células T, monócitos, células B) vs CD56 (células NK) gating na população CD56 pos neg andCD3/14/20 (NK porta). (D) NK portão plotados como CD107a vs CD56 para visualizar as células NK que desgranulados (CD107a pos). Figura 4. Etapas envolvidas na construção de um ensaio de liberação de 51 Cr utilizando células NK como efetores e células K562, CD4 + não infectadas e células T infectadas pelo HIV-1 células T como alvos. Figura 5. Resultados representativos para avaliar a resposta citotóxica de natural killer contra o HIV-1 células infectadas. (A) células NK foram avaliados por sua capacidade de degranulam sem metas e em resposta a K562 células CD4 principal + T-cells e infectados pelo HIV primários de células T avaliada pelo percentual de células NK que CD107a superfície expressar. Os números em cada quadrante representam a porcentagem do total de células NK. B) As células NK são avaliados pela sua capacidade de lisar células K562, CD4 + não infectadas e células T infectadas pelo HIV-1 células-T em um ensaio de liberação de 51 Cr na célula efetora diferentes para atingir rácios de celular (E: T).