La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

Figura 1. Esquema de SESI-MS análisis de compuestos volátiles de bacterias. El espacio libre del cultivo bacteriano es desplazado por el CO 2 (1) en la cámara de reacción del SESI (2). Como los compuestos volátiles atravesar la cámara de reacción SESI pasan a través de la nube de electrospray y se ionizan (3). Una vez ionizados, los volátiles son introducidos en el espectrómetro de masas para el análisis (4). El exceso de gas portador y que no ha reaccionado volátiles bacterias se transmiten a través de un filtro de 0,22 micras (5), como una medida adicional de protección y ventilación a una campana química. Recuadro: La aguja electrospray SESI es un capilar de sílice (40 micras ID) con una punta de aguja afilada. Como una demostración de la utilización de SESI-MS para la caracterización de compuestos volátiles de bacterias, E. coli K12 y P. PAO1 aeruginosa son cultivadas aeróbicamente durante 24 horas en 50 ml de LB-Lennox a 37 ° C y los espectros de SESI-MS de los volátiles del espacio de cabeza se recogen en 2 minutos. El dióxido de carbono (99,99%) con un caudal de 2 l / min se usa como gas de transporte para la entrega de volátiles a la cámara de reacción. La cámara de reacción SESI fue construida y equipada a un API-3000 (Sciex), en sustitución de la fuente de electrospray ión original. Los espectros se recogen en el modo de iones positivos con 0,1% de ácido fórmico, el 5,0% de metanol, y el 94,9% de agua (v / v) como la solución electrospray, entregado en 5 nl / s a ​​través de un contenido de sílice no conductora capilar con una punta de aguja afilada (40 micras ID). El voltaje aplicado es de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) se utiliza para la recolección de datos con los siguientes parámetros: 20 – 500 Da, MCA modo, 40 escáneres, 3 s / escaneo, y 2 min de tiempo total de análisis. 1. Sistema de cultivo Elegir el recipiente adecuado para el crecimiento de sus cultivos, teniendo en cuenta las necesidades de crecimiento de la especie en el experimento (por ejemplo, la aireación, luz, temperatura, etc), así como la prestación eficiente de los volátiles que el espectrómetro de masas. Los frascos de cultivo que optar por utilizar son estándar de 100 ml Pyrex botellas de los medios de comunicación equipados con tapas de rosca que tienen al menos dos puertos luer. Una línea de entrada se inserta a través de un puerto luer para la entrega de gas portador de la botella de muestra y una línea de salida se inserta a través de otro puerto para la entrega de VOC en el instrumento (Figura 1). Cualquiera de los puertos adicionales están conectados. Antes de que el cultivo de las muestras, presionar a los vasos y se sumergen en el agua para detectar fugas. Las fugas de gas son la principal causa de los resultados atípicos en forma de señales de iones débil o ausente volátiles. 2. Biológica experimento: puesta a punto y de seguridad consideraciones El crecimiento de su cultura en las condiciones adecuadas para su hipótesis. Se recomienda que al menos dos réplicas biológicas, cada uno con dos repeticiones técnica, se utilizan para cada variable. Preparar un blanco de todas las condiciones de cultivo (medio, antibióticos, etc) e incubar el espacio en blanco en las mismas condiciones que sus muestras. Emplear las medidas de seguridad que son apropiados para los agentes biológicos que está utilizando, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad (s) de la especie. Para evitar la contaminación de su instrumento y las líneas de transferencia de gas con agentes biológicos viables, instalar filtros de tamaño de poro adecuado en la línea de gas portador. Los filtros no interfieren con la transferencia de compuestos volátiles de la cámara de reacción del SESI, pero poco puede afectar la eficiencia de la transferencia de aerosol. 6 Utilícese un envase secundario o un gabinete de bioseguridad cuando se conecta la tapa de transferencia de gas a su botella de la cultura de asegurar la contención adecuada en el caso de derrame de agentes biológicos. Iniciar y terminar el flujo de gas portador a su botella de muestra de una manera que no va a construir la presión dentro de la botella. 3. Instrumento de optimización NOTA: SESI-MS está diseñado específicamente para los volátiles de la muestra, por lo que limitar el uso de fragantes artículos de cuidado personal (por ejemplo, colonias, enjuagues bucales, lociones, suavizante de telas), goma de mascar, cigarrillos, etc antes de usar el instrumento. Bien colmo productos químicos volátiles en el laboratorio y de control de los borradores tanto como sea posible durante la prueba. Los siguientes parámetros instrumentales, que afectan a la intensidad de la señal y la estabilidad, tendrá que ser optimizado para su instrumento y la experimentación. Solución de electrospray y el caudal: Elegir la solución electrospray apropiado para la clase de moléculas que desea dirigirse, teniendo en cuenta la polaridad instrumento operativo (modo positivo o negativo de iones) y el carácter molecular de los compuestos de interés. En este experimento la solución electrospray es del 0,1% ácido fórmico, el 5,0% de metanol, el 94,9% de agua (v / v), lo que aumenta la intensidad de la señal de menos moléculas polares noce dar estabilidad buena señal. La solución se entrega con un caudal de 5 nL / s. Velocidad del gas portador: El caudal del gas portador puede afectar la estabilidad de electrospray y la intensidad de la señal. CO 2 (≥ 99,99%) con un caudal de 2 l / min se utiliza aquí. Forma de aguja y posición: La forma de punta de la aguja y la posición afectan en gran medida la intensidad de la señal y la estabilidad. Al instalar una nueva aguja, la posición de la aguja debe ser optimizado para crear un equilibrio entre el fondo de baja y alta intensidad de la señal del analito, y la estabilidad de la señal. Con el fin de reproducir los espectros SESI después de un cambio de agujas, es necesario recoger periódicamente los espectros a medida que ajusta la posición de la aguja hasta que pueda para que coincida con el espectro observado a sus registros. La distancia desde la punta de la aguja a la masa electrospray orificio de especificaciones será de 1 – 5 mm. Tensión aplicada: La tensión que se aplica en el sistema afecta a la intensidad de la señal de iones y la estabilidad del cono electrospray Taylor. Además, el voltaje óptimo depende de la solución de electrospray y la forma de punta de la aguja. Al inicio de su serie de experimentos, determine la tensión que produce el espectro óptimo y estabilidad de la señal para el sistema, y ​​luego utilizar esta tensión para todos los experimentos posteriores. Para nuestro sistema, voltajes aplicados de 2,0 a 5,0 kV proporcionar una intensidad de señal óptima y la estabilidad de electrospray. Para este experimento se utiliza 2,5 kV. 4. Encendido y puesta a punto del SESI-MS para el análisis Comenzar por asegurar que la tensión de alimentación está apagado y que el sistema está cargado de electricidad. Para ello, 1) asegurar que las luces indicadoras de la tensión de alimentación están apagados, 2) asegurar la tensión en el multímetro es cero, y 3) a tierra los cables eléctricos. Instalar la solución de electrospray apropiado para su experimento. Encienda el gas portador y establecer el flujo a la velocidad adecuada para su experimento. Aplicar presión en el depósito de electrospray para iniciar la entrega de la solución de electrospray a la cámara de reacción. Abra el suministro de tensión y ajustar el voltaje a un valor apropiado para sus experimentos. NOTA: En este punto, las superficies metálicas de la fuente de ionización son capaces de entregar un choque peligroso. Tener mucho cuidado cuando se trabaja alrededor del instrumento una vez que la tensión de alimentación se ha activado. Configuración de un método de ajuste para el monitoreo del espectro SESI-MS al tiempo que afinar los ajustes de la tensión aplicada. Use los parámetros de adquisición que se ha optimizado para su sistema y su experimento. Autorizar la adquisición de canales múltiples (MCA) casilla (si corresponde) a fin de que cada ciclo produce un espectro independiente, establecer el tiempo de adquisición de 10 – 15 min, y comenzar la adquisición. Espectros de los antecedentes del gas portador ahora deben ser observados. Hacer ajustes ajustado a la tensión aplicada para obtener un cromatograma total de iones estables (TIC) y las exploraciones reproducible que coinciden con el CO 2 analiza en busca de sus experimentos anteriores. Una vez que los ajustes de voltaje se han hecho, continuar recogiendo los espectros y un TIC durante cinco minutos para asegurar que el instrumento se estabilice. Una vez que se garantiza la estabilidad fundamental, establecer el método de adquisición según sea apropiado para sus muestras, ajustar el tiempo de adquisición, el rango de datos, y la selección de MCA, según sea necesario. Recoger el gas portador del espectro de fondo para sus registros. 5. La obtención de una huella digital volátil de su cultivo bacteriano Para recoger un espectro blanco, dirigir el flujo de gas portador a través de las líneas de derivación, y luego coloque la muestra en blanco (válvulas cerradas) a las líneas de transferencia de gas del instrumento. Abrir las válvulas de la botella de muestra, y cerrar las válvulas de las líneas de derivación. Deje que el sistema se equilibre durante 30 segundos, tiempo durante el cual la humedad en la cámara de reacción se está estabilizando. Este período de equilibrio es esencial para obtener espectros reproducibles. Para asegurar que el sistema está equilibrado, es posible que desee monitorear las TIC, que va a cambiar durante el período de equilibrio, y estabilizar a partir de entonces. Una vez que el sistema está equilibrado, iniciar la recogida de espectro. Después de que el espectro se recoge, retire la botella de muestra, en primer lugar la apertura de las líneas de gas portador de bypass, luego cerrar las válvulas de la muestra, y por último la eliminación de la botella de muestra. Lave el sistema con el gas portador de 2 a 4 min, la eliminación de la humedad y volátiles adsorbidos en las líneas de transferencia, la prevención de la muestra de la muestra de arrastre. Repita los pasos 5,2 a 5,5 por cada muestra de bacterias, de forma intermitente recogida de espectros en blanco adicionales para asegurar una buena blanco resta. Incompleta en blanco resta dará lugar a laaparición de picos de fondo químico en el espectro de procesados ​​que son comunes a técnicas de presión atmosférica de ionización (por ejemplo, los ftalatos, siliconas, etc.) 9 Al recoger su espectro, asegúrese de que las señales de iones no son superiores a los límites de detección lineal de su instrumento, según lo determinado por las TIC y la máxima intensidad de los diferentes picos. Iones rebasen los límites superiores del detector de su instrumento puede generar picos de artefactos que no son representativos de la muestra. 6. Resultados representante Como ejemplo de los espectros de SESI-MS que se pueden obtener de los volátiles de bacterias, las huellas dactilares de iones positivos modo volátil para E. coli y P. aeruginosa crecido en condiciones aeróbicas LB-Lennox durante 24 horas a 37 ° C se muestran (Fig. 2). La E. espectro coli volátiles está dominado por indol en m / z = 118, que ofrece E. culturas coli su olor característico, mientras que el espectro de la P. aeruginosa contiene una mayor variedad de picos protonatable. Tenga en cuenta que las intensidades relativas de los picos en el espectro de volatilidad dependen de los parámetros instrumentales se describe en la Sección 3. Estos parámetros deben ser estrictamente controlados de experimento en experimento con el fin de obtener espectros reproducibles. Figura 2 en blanco sustracción de iones positivos modo SESI-MS espectros (20 – 150 m / z). De E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1 volátiles después de 24 h de crecimiento aeróbico en LB-Lennox a 37 ° C. Para más detalles sobre los picos observados en el espectro de SESI, por favor refiérase a Zhu, et al. 8.