Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Figura 1. Schematica SESI-MS per l'analisi di sostanze volatili batterica. Spazio di testa della coltura batterica è spostato da CO 2 (1) nella camera di reazione SESI (2). Come il volatiles attraversano la camera di reazione SESI passano attraverso la nube electrospray e diventare ionizzato (3). Una volta ionizzato, i volatili sono tirato in spettrometro di massa per l'analisi (4). Gas di trasporto in eccesso e che non ha reagito volatili batterica sono passati attraverso un filtro di 0,22 micron (5), come ulteriore misura di protezione, e ventilati per una cappa chimica. Riquadro: L'ago elettrospray SESI è un capillare in silice (40 ID micron) con una punta dell'ago affilata. A dimostrazione dell'uso di SESI-MS per la caratterizzazione di sostanze volatili batteriche, E. coli K12 e P. PAO1 aeruginosa sono coltivate in aerobiosi per 24 ore in 50 mL di LB-Lennox a 37 ° C e la SESI-MS spettri dei volatili spazio di testa sono raccolti in 2 minuti. L'anidride carbonica (99,99%) ad un flusso di 2 L / min viene usato come gas di trasporto per la consegna volatili della camera di reazione. La camera di reazione SESI è stato su misura e dotato di una API-3000 (SCIEX), sostituendo l'originale sorgente di ioni electrospray. Gli spettri sono raccolti in modalità ioni positivi con lo 0,1% acido formico, metanolo 5,0%, e 94,9% di acqua (v / v) come la soluzione electrospray, consegnato a 5 Nl / s attraverso un non-conduttivo capillare in silice con una punta dell'ago affilata (40 ID micron). La tensione applicata è di 2,5 kV. Analista 1.4.2 del software (Applied Biosystems) viene utilizzato per la raccolta dati con i seguenti parametri: 20-500 Da, MCA modalità, 40 scansioni, 3 s / scansione, e 2 minuti il ​​tempo di analisi totale. 1. Sistema di coltura Scegli il vaso adatto per far crescere la vostra culture, tenendo conto delle esigenze di crescita della specie nel tuo esperimento (ad esempio, aerazione, luce, temperatura, ecc), così come la consegna efficiente dei volatili allo spettrometro di massa. Le bottiglie cultura che sceglie di utilizzare sono standard 100 mL in Pyrex bottiglie di mezzi dotati di tappi filettati che hanno almeno due porte luer. Una linea in ingresso viene inserito attraverso una porta luer vettore per la consegna del gas alla bottiglia campione e una linea di uscita viene inserito attraverso un'altra porta per la consegna di COV allo strumento (Figura 1). Eventuali ulteriori porte sono collegati. Prima di coltura dei campioni, pressurizzare i vasi e immergere in acqua per controllare eventuali perdite. Fughe di gas sono una causa primaria di risultati atipici, sotto forma di segnali deboli o assenti agli ioni di volatili. 2. Esperimento biologico: set-up e le considerazioni di sicurezza Fai crescere la tua culture nelle condizioni appropriate per la tua ipotesi. Si raccomanda che almeno due repliche biologiche, ciascuna con due tecnici si replica, vengono utilizzati per ogni variabile. Preparare un bianco per ogni condizione di cultura (medio, antibiotici, ecc) e incubare il bianco nelle stesse condizioni dei vostri campioni. Utilizzare misure di sicurezza che sono appropriati per gli agenti biologici in uso, prendendo in considerazione il livello di biosicurezza (s) della specie. Per prevenire la contaminazione dello strumento e le linee di trasferimento del gas con praticabile agenti biologici, installare i filtri delle dimensioni dei pori appropriato nella linea di gas di trasporto. I filtri non interferisce con il trasferimento delle sostanze volatili della camera di reazione SESI, ma può leggermente impatto l'efficienza del trasferimento aerosol 6. Usare contenitori secondari o un armadietto biosicurezza quando si collega il tappo del trasferimento del gas per la vostra bottiglia cultura per garantire il contenimento adeguato nel caso di versamento di agenti biologici. Avviare e interrompere il flusso del gas vettore per la vostra bottiglia campione in un modo che non costruirà la pressione all'interno della bottiglia. 3. Strumento di ottimizzazione NOTA: SESI-MS è specificamente progettato per volatili del campione, in modo da limitare l'uso di fragrante articoli per la cura personale (ad esempio, colonie, collutorio, lozioni, ammorbidente), gomme, sigarette, ecc prima di utilizzare lo strumento. Strettamente tappo tutte le sostanze chimiche volatili in laboratorio, e l'aria di controllo bozze il più possibile durante il test. I seguenti parametri strumentali, che tutti influenzare l'intensità del segnale e stabilità, dovrà essere ottimizzata per il vostro strumento e sperimentare. Soluzione electrospray e portata: Scegli la soluzione adatta electrospray per la classe di molecole che si desidera target, tenendo conto della polarità strumento operativo (modo positivo o negativo di litio) e il carattere molecolare dei composti target. In questo esperimento la soluzione electrospray è 0,1% di acido formico, metanolo 5,0%, 94,9% di acqua (v / v), che aumenta l'intensità del segnale di meno molecole polari while fornisce una buona stabilità del segnale. La soluzione è consegnato ad un flusso di 5 nL / s. Flusso del gas: il flusso del gas vettore può influenzare la stabilità electrospray e l'intensità del segnale. CO 2 (≥ 99,99%) ad un flusso di 2 L / min è usato qui. Forma e la posizione dell'ago: La forma punta dell'ago e la posizione fortemente influenzare l'intensità del segnale e stabilità. Quando si installa un nuovo ago, la posizione dell'ago deve essere ottimizzata per creare un equilibrio tra lo sfondo a bassa e ad alta intensità del segnale analita e stabilità del segnale. Al fine di riprodurre gli spettri SESI dopo un cambio di ago, è necessario raccogliere periodicamente spettri come si regola la posizione dell'ago finché non si è in grado di corrispondere al spettro osservato al tuo record. La distanza dalla punta elettrospray ago a orifizio massa spec sarà di 1 – 5 mm. Tensione applicata: La tensione che viene applicata al sistema influenza l'intensità del segnale di ioni e la stabilità della Taylor elettrospray cono. Inoltre, la tensione ottimale dipende dalla vostra soluzione elettrospray e la forma della punta dell'ago. All'inizio della vostra serie di esperimenti, determinare la tensione che produce lo spettro ottimale e la stabilità del segnale per il sistema, e quindi utilizzare questa tensione per tutti gli esperimenti successivi. Per il nostro sistema, tensioni applicate di 2,0-5,0 kV fornire intensità ottimale del segnale e stabilità elettrospray. Per questo esperimento 2,5 kV viene utilizzato. 4. Accensione e messa a punto del SESI-MS per l'analisi Iniziare facendo in modo che la tensione di alimentazione sia spento e che il sistema è di scaricare l'elettricità. A tale scopo 1) assicurare l'indicatore sulla tensione di alimentazione sono spenti, 2) garantire la tensione sul multimetro è pari a zero, e 3) la messa a terra i cavi elettrici. Installare la soluzione appropriata electrospray per l'esperimento. Accendere il gas di trasporto e impostare il flusso verso il tasso appropriato per l'esperimento. Applicare una pressione al serbatoio electrospray di avviare la fornitura della soluzione elettrospray della camera di reazione. Accendere la tensione di alimentazione e regolare la tensione su un valore appropriato per i vostri esperimenti. NOTA: A questo punto le superfici metalliche della sorgente di ionizzazione sono in grado di fornire una scossa pericolosa. Esercitare grande cautela quando si lavora intorno allo strumento una volta che la tensione di alimentazione è stata accesa. Impostare un metodo di messa a punto per il monitoraggio del SESI-MS spettro rendendo messo a punto modifiche alla tensione applicata. Utilizzare i parametri di acquisizione che hanno ottimizzato per il sistema e l'esperimento. Deselezionare la multipla Acquisizione Channel (MCA) casella di controllo (se applicabile) in modo che ad ogni scansione produce uno spettro indipendente, impostare il tempo di acquisizione a 10 – 15 min, e avviare l'acquisizione. Spettri del fondo gas di trasporto dovrebbe essere osservato. Fai messo a punto modifiche alla tensione applicata per ottenere un cromatogramma stabile ione totale (TIC) e scansioni riproducibile che corrispondono al CO 2 scansioni per i vostri esperimenti precedenti. Una volta che le regolazioni di tensione sono stati compiuti, continuare a raccogliere spettri e una TIC per cinque minuti per assicurare lo strumento è stabilizzato. Una volta stabilità strumentale è assicurata, impostare il metodo di acquisizione a seconda dei casi per i tuoi campioni, regolando il tempo di acquisizione, intervallo di dati, e la selezione MCA, se necessario. Raccogliere un gas spettro vettore sfondo per il vostro record. 5. Ottenere una impronta digitale volatili della vostra cultura batterica Per raccogliere uno spettro bianco, diretto il flusso di gas di trasporto attraverso le linee di bypass, e quindi collegare il campione in bianco (valvole chiuse) alle linee trasferire il gas dello strumento. Aprire le valvole alla bottiglia campione e chiudere le valvole delle linee di bypass. Lasciare che il sistema si stabilizzi per 30 secondi, durante i quali l'umidità nella camera di reazione si sta stabilizzando. Questo periodo di equilibrio è fondamentale per ottenere spettri riproducibile. Per garantire che il sistema è equilibrato, si potrebbe voler controllare il TIC, che cambierà durante il periodo di equilibrio, e stabilizzare in seguito. Una volta che il sistema è equilibrato, avviare la raccolta dello spettro. Dopo lo spettro viene raccolta, rimuovere la bottiglia campione per la prima apertura del gas linee di bypass vettore, poi la chiusura delle valvole del campione, e infine la rimozione della bottiglia di campionamento. Lavare il sistema con il gas di trasporto per 2 – 4 minuti, eliminando l'umidità e sostanze volatili assorbiti dalle linee di trasferimento, impedendo campione a campione riporto. Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni campione batterica, a intermittenza raccogliendo ulteriori spettri vuoto per assicurare un completo vuoto sottrazione. Incompleti vuoto sottrazione porterà allacomparsa di picchi chimici sfondo nella vostra spettro elaborati che sono comuni alle tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica, (ad esempio, gli ftalati, siliconi, ecc) 9. Al momento del ritiro spettri, sì che i segnali di ioni non sono superiori ai limiti di rilevazione lineare del vostro strumento, come determinato dal TIC e l'intensità massima dei singoli picchi. Ioni di superare i limiti superiore del rivelatore del tuo strumento in grado di generare picchi di artefatto che non sono rappresentativi del campione. 6. Rappresentante Risultati Come esempio del SESI-MS spettri che possono essere ottenuti per volatili batterica, il modo positivo le impronte digitali agli ioni di volatili per E. coli e P. aeruginosa cresciuto in condizioni aerobiche LB-Lennox per 24 ore a 37 ° C sono riportati (Fig. 2). La E. coli volatili spettro è dominato da indolo a m / z = 118, che dà E. culture coli il loro odore caratteristico, mentre lo spettro di P. aeruginosa contiene una grande varietà di picchi protonatable. Si prega di notare che l'intensità relativa dei picchi nello spettro volatili dipendono i parametri strumentali descritto nella Sezione 3. Questi parametri devono essere strettamente controllati dalla fase sperimentale alla sperimentazione al fine di ottenere spettri riproducibile. Figura 2 Blank-sottratto agli ioni positivi modalità SESI-MS spettri (20 – 150 m / z). Di E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1 volatili dopo 24 ore di crescita aerobica a LB-Lennox a 37 ° C. Per ulteriori dettagli sui picchi osservati negli spettri SESI, consultare Zhu, et al. 8.