נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)

באיור 1. סכמטי לניתוח SESI-MS של נדיפים חיידקי. אמיץ של התרבות חיידקי שנעקרו על ידי CO 2 (1) החדרה התגובה SESI (2). כפי נדיפים לעבור את תא התגובה SESI כשהם עוברים דרך ענן electrospray ולהיות מיונן (3). מיונן פעם, נדיפים הם משכו לתוך ספקטרומטר מסה לניתוח (4). גז המוביל עודף נדיפים חיידקי unreacted הם עברו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (5), כאמצעי הגנה נוספים, פרקו את מכסה המנוע כימי. הבלעה: מחט electrospray SESI הוא סיליקה נימי (40 מזהה מיקרומטר) עם קצה מחודד ומחט. כמו הפגנה של השימוש SESI-MS לאפיון של נדיפים חיידקים, E. coli K12 ו פ PAO1 aeruginosa הם מתורבתים aerobically ב 37 שעות במשך 24 מ"ל ב 50 LB-לנוקס ° C ואת ספקטרום SESI-MS של נדיפים אמיץ נאספים 2 דקות. דו תחמוצת הפחמן (99.99%) בקצב זרימה של L 2 / min משמש הגז המוביל למסירה נדיפים לתא התגובה. תא התגובה SESI היה מנהג נבנה מצויד ה-API-3000 (SCIEX), להחליף את המקור יון electrospray. ספקטרה נאספים במצב יון חיובי באמצעות חומצה פורמית 0.1%, מתנול 5.0% ו 94.9% מים (v / v) כפתרון electrospray, שנשא 5 NL / s דרך סיליקה שאינו מוליך נימי עם קצה מחודד ומחט (40 מזהה מיקרומטר). המתח הוא מיושם 2.5 kV. 1.4.2 אנליסט תוכנה (Applied Biosystems) משמש לאיסוף נתונים עם הפרמטרים הבאים: 20-500 דה, MCA מצב, 40 סריקות, 3 s / סריקה, ו -2 דקות הזמן הכולל ניתוח. 1. Culturing מערכת בחר את הכלי המתאים לגידול תרביות שלך, בהתחשב בדרישות הגידול של מינים של הניסוי שלך (למשל, אוורור אור, טמפרטורה וכו '), כמו גם אספקה ​​יעילה של נדיפים כדי ספקטרומטר מסה. הבקבוקים תרבות אנחנו בוחרים להשתמש הם סטנדרטיים 100 מ"ל פיירקס בקבוקי המדיה מצויד כמוסות הליכי כי יש לפחות שתי יציאות luer. קו היניקה מוחדר דרך בנמל אחד luer למסירה המוביל גז הבקבוק מדגם קו לשקע מוחדר דרך נמל אחר למסירה VOC אל המכשיר (איור 1). כל יציאות נוספות מחוברים. לפני culturing דגימות, לחצים על כלי שיט לצלול במים כדי לבדוק דליפות. דליפות גז הם הגורם העיקרי תוצאות טיפוסיות בצורת אותות חלשים או נעדרים יון נדיפים. 2. ניסוי ביולוגי: הגדרת הבטיחות שיקולים לגדול תרבויות שלך בתנאים המתאימים ההשערה שלך. מומלץ כי לפחות שני ביולוגי משכפל, כל אחד עם שתי טכניות משכפל, משמשים עבור כל משתנה. הכן ריק עבור כל מצב התרבות (בינוני, אנטיביוטיקה, וכו ') דגירה ריק באותם תנאים כמו דגימות שלך. להעסיק אמצעי הבטיחות המתאימים גורמים ביולוגיים אתה משתמש, תוך התחשבות ברמת biosafety (ים) של המינים. כדי למנוע זיהום של המכשיר שלך והעברת קווי גז עם גורמים ביולוגיים קיימא, להתקין פילטרים של גודל הנקבוביות המתאים לתוך הקו המוביל את הגז. המסננים לא יפריע להעברת נדיפים לתא התגובה SESI, אבל אולי מעט השפעה על יעילות העברת אירוסול. 6 השתמש בלימה משנית או קבינט biosafety בעת צירוף את הכובע העברת הגז בקבוק התרבות שלך כדי להבטיח את הבלימה הנכונה במקרה של שפיכת גורמים ביולוגיים. ליזום הפסקת זרימת הגז המוביל אל בקבוק מדגם שלך בצורה לא תבנה הלחץ בתוך הבקבוק. 3. כלי אופטימיזציה הערה: SESI-MS היא תוכננה במיוחד כדי נדיפים המדגם, כך להגביל את השימוש ריחני פריטים טיפול אישי (למשל, מי קולון, מי פה, קרם לחות, מרכך), מסטיקים, סיגריות וכו 'לפני השימוש במכשיר. חזק כובע כל כימיקלים נדיפים במעבדה, ואוויר לשלוט טיוטות ככל האפשר במהלך הבדיקה. הפרמטרים הבאים אינסטרומנטלי, אשר משפיעים על עוצמת האות ואת היציבות, יהיה צורך אופטימיזציה עבור כלי הניסוי שלך. פתרון electrospray וקצב הזרימה: בחר את הפתרון המתאים electrospray לשיעור של מולקולות ברצונך להתמקד, תוך לקיחה בחשבון את המכשיר ההפעלה הקוטביות (מצב חיובי או שלילי-ion) ואת האופי המולקולרי של תרכובות מטרה. בניסוי זה הפתרון electrospray הוא חומצה פורמית 0.1%, מתנול 5.0%, 94.9% מים (V / V), אשר משפר את עוצמת האות של מולקולות קוטביות פחות whilהדואר לספק יציבות אות טוב. הפתרון מועבר בקצב הזרימה של 5 NL / s. גז המוביל קצב זרימה: גז הספק קצב הזרימה יכולה להשפיע על יציבות electrospray ועוצמת האות. CO 2 (≥ 99.99%) בקצב זרימה של L 2 / min משמש כאן. צורת מחט ואת המיקום: קצה מחט הצורה ואת המיקום מאוד משפיע על עוצמת האות ויציבות. בעת התקנת מחט חדשה, המיקום של המחט צריך להיות מותאם כדי ליצור איזון בין הרקע נמוך, בעוצמה גבוהה אות אנליטי, ויציבות האות. על מנת לשחזר ספקטרה SESI לאחר שינוי מחט, יש צורך מעת לעת לגבות ספקטרה כפי שאתה להתאים את מיקום המחט עד שתוכלו להתאים את ספקטרום נצפתה הרשומות שלך. המרחק בין קצה מחט electrospray אל פתח spec המונית יהיה 1-5 מ"מ. מתח יישומית: מתח המוחלת על המערכת משפיעה על עוצמת האות יון ואת היציבות של טיילור electrospray חרוט. בנוסף, מתח אופטימלית תלויה פתרון electrospray שלך ואת צורת קצה המחט. בתחילת הסדרה שלך של ניסויים, לקבוע את המתח כי התשואות ספקטרום אופטימלי ויציבות האות עבור המערכת שלך, ולאחר מכן להשתמש מתח עבור כל הניסויים הבאים. עבור המערכת שלנו, מתח של 2.0-5.0 kV לספק עוצמת האות אופטימלית ויציבות electrospray. לצורך ניסוי זה 2.5 kV משמש. 4. הפעלת וכוונון SESI-MS לניתוח בגין, על ידי הבטחת כי אספקת מתח מבוטלת וכי מערכת ריקה של חשמל. לעשות זאת על ידי 1) להבטיח את נוריות החיווי על אספקת מתח כבויים, 2) להבטיח את המתח על מודד הוא אפס, ו 3) הארקה מוביל חשמל. התקן את הפתרון המתאים electrospray עבור הניסוי שלך. הפעל גז המוביל ולהגדיר את זרימת קצב המתאים עבור הניסוי שלך. החל הלחץ המאגר electrospray ליזום את אספקת פתרון electrospray לתא התגובה. הפעל את אספקת מתח ולהתאים את מתח לערך המתאים לניסויים שלך. הערה: בשלב זה משטחי מתכת מקור יינון מסוגלים לספק הלם מסוכן. תרגיל בזהירות רבה כאשר עובדים סביב המכשיר פעם אספקת מתח הופעל. הגדרת שיטת כוונון לניטור ספקטרום SESI-MS תוך מכויל התאמות מתח מיושם. שימוש בפרמטרים הרכישה שיש לך אופטימיזציה עבור המערכת שלך הניסוי. נקה את ערוץ מרובים רכישה (MCA) תיבת הסימון (אם קיים) כדי לסרוק את כל הספקטרום מייצר עצמאית, לקבוע את זמן הרכישה עד 10 – 15 דקות, ולהתחיל את הרכישה. ספקטרה הרקע גז המוביל כעת אמור להיות שנצפו. הפוך את מכויל התאמות מתח להחיל להשיג chromatogram יציב יון הכולל (עוית) וסריקות לשחזור התואמים את ה-CO 2 סריקות לניסויים הקודמים שלך. לאחר התאמות מתח נעשו, ממשיכים לאסוף ספקטרה ועוד עוית ​​במשך חמש דקות, כדי להבטיח את המכשיר הוא התייצב. לאחר יציבות אינסטרומנטלי מובטחת, להגדיר את שיטת הרכישה, בהתאם דגימות שלך, כדי להתאים את זמן הרכישה, טווח הנתונים, ואת הבחירה MCA כנדרש. איסוף גז המוביל רקע ספקטרום עבור הרשומות שלך. 5. קבלת טביעת אצבע נדיף של התרבות חיידקי שלך כדי לאסוף קשת ריק, לכוון את זרימת הגז המוביל דרך לעקוף את הקווים, ולאחר מכן לצרף את המדגם ריק (שסתומים סגורים) כדי להעביר קווי גז של המכשיר. פתח את השסתומים כדי בקבוק המדגם, ולסגור את השסתומים של קווי מעקף. אפשר מערכת לאזן למשך 30 שניות, במהלכן הלחות בחדר התגובה היא ייצוב. זו תקופה של איזון הכרחי להשגת ספקטרום לשחזור. על מנת להבטיח כי המערכת היא equilibrated, מומלץ לעקוב אחר עוית, אשר ישתנו במהלך תקופת איזון, ולייצב לאחר מכן. ברגע שהמערכת equilibrated, ליזום איסוף ספקטרום. לאחר הקשת נאסף, להסיר את הבקבוק מדגם קודם כל פתיחת גז המוביל קווי מעקף, ואז סגירת שסתומים מדגם, ולבסוף הסרת בקבוק המדגם. לרוקן את המערכת עם גז המוביל עבור 2-4 דקות, להסיר את הלחות נדיפים adsorbed מקווי ההעברה, למניעת המדגם ל-מדגם שריד. חזור על שלבים 5.2-5.5 עבור כל דגימה חיידקי, לסירוגין איסוף ספקטרום ריק נוסף כדי להבטיח חיסור ריק יסודית. חיסור ריק הושלמה יובילהמראה של רקע פסגות כימיים בספקטרום מעובד שלך המשותפים טכניקות יינון לחץ אטמוספרי, (למשל, פתלטים, סיליקון וכו '). 9 כאשר איסוף ספקטרום שלך, להבטיח את האותות יון לא לעבור את גבולות איתור ליניארי של המכשיר שלך, כפי שנקבע על ידי עוית ​​ואת עוצמתו המרבית של פסגות בודדים. יונים מעל המגבלות העליון של גלאי המכשיר שלך יכול לייצר פסגות חפץ, כי הם לא מדגם מייצג של שלך. 6. נציג תוצאות כדוגמה ספקטרה SESI-MS כי ניתן לקבל עבור נדיפים חיידקי, במצב חיובי יון טביעות אצבעות נדיפים עבור E. coli ו פ aeruginosa גדל aerobically במשך 24 שעות בתוך לנוקס LB ב 37 ° C מוצגים (איור 2). E. coli ספקטרום תנודתי נשלט על ידי אינדול ב m / z = 118, אשר נותן E. coli תרבויות ריח אופייני שלהם, ואילו הקשת של פ aeruginosa מכיל מגוון גדול יותר של פסגות protonatable. שים לב לעוצמות היחסי של פסגות בספקטרום נדיפים תלויים בפרמטרים אינסטרומנטלי המתואר בסעיף 3. פרמטרים אלה חייבים להיות מבוקרים היטב מניסוי לניסוי על מנת לקבל ספקטרום לשחזור. איור 2 בלנק, מחוסר יון חיובי במצב SESI-MS ספקטרה (20 – 150 מ '/ z). של E. coli K12 ו פ aeruginosa PAO1 נדיפים לאחר צמיחה h 24 אירובית לנוקס LB ב 37 ° C. לפרטים נוספים על הפסגות שנצפתה הספקטרום SESI, אנא פנה אל ג'ו, et al. 8.