Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Figuur 1. Schematische voor Sesi-MS analyse van bacteriële vluchtige stoffen. De kopruimte van de bacteriële cultuur is verdrongen door CO 2 (1) in de Sesi reactie kamer (2). Omdat de vluchtige stoffen doorkruisen de Sesi reactiekamer ze door de electrospray wolk en worden geïoniseerd (3). Eenmaal geïoniseerd worden de vluchtige stoffen getrokken in de massaspectrometer voor analyse (4). Overtollige draaggas en ongereageerd bacteriële vluchtige stoffen worden doorgegeven door een 0,22 um filter (5), als een aanvullende maatregel van bescherming, en geventileerd om een ​​chemische kap. Inzet: De Sesi electrospray naald is een silica capillair (40 um ID) met een scherpe naald. Als een demonstratie van het gebruik van Sesi-MS voor de karakterisering van bacteriële vluchtige stoffen, E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1 aëroob gekweekt gedurende 24 uur in 50 ml LB-Lennox bij 37 ° C en de Sesi-MS spectra van de headspace vluchtige stoffen worden verzameld in 2 minuten. Kooldioxide (99,99%) bij een debiet van 2 l / min wordt gebruikt als draaggas voor vluchtige levering aan de reactie kamer. De reactie Sesi kamer werd op maat gebouwd en gemonteerd op een API-3000 (Sciex), ter vervanging van de oorspronkelijke electrospray ionenbron. De spectra worden verzameld in de positieve ion-modus met 0,1% mierenzuur, 5,0% methanol, en 94,9% water (v / v) als de electrospray-oplossing, geleverd op 5 nL / s via een niet-geleidende silica capillair met een geslepen naald (40 um ID). De aangelegde spanning is 2,5 kV. Analist 1.4.2 software (Applied Biosystems) wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens met de volgende parameters: 20 – 500 Da, MCA-modus, 40 scans, 3 s / scan, en 2 min totale analyse tijd. 1. Het kweken van het systeem Choose het juiste schip voor de teelt van uw culturen, gezien de groei eisen van de soort in uw experiment (bijvoorbeeld, beluchting, licht, temperatuur, enz.), alsmede de efficiënte levering van vluchtige stoffen naar de massaspectrometer. De cultuur flessen we kiezen om te gebruiken zijn standaard 100 ml Pyrex media flessen voorzien van doppen met schroefdraad dat ten minste twee luer-poorten te hebben. Een toevoer lijn wordt ingebracht via een luer-poort voor het draaggas levering aan de monsterfles en een uitlaat lijn wordt ingebracht via een andere poort voor de VOC levering aan het instrument (figuur 1). Eventuele extra poorten zijn aangesloten. Voorafgaand aan het kweken van de monsters, onder druk van de schepen en onderdompelen in water om te controleren op lekkages. Gaslekken zijn een primaire oorzaak van atypische resultaten in de vorm van zwakke of afwezige vluchtige ion signalen. 2. Biologische experiment: set-up-en veiligheidsoverwegingen Kweek je culturen in de voorwaarden die geschikt is voor uw hypothese. Het wordt aanbevolen dat ten minste twee biologische replica, elk met twee technische herhalingen, worden gebruikt voor elke variabele. Bereid een blanco voor elke cultuur staat (medium, antibiotica, enz.) en incubeer de lege onder dezelfde voorwaarden als uw monsters. Gebruiken veiligheidsmaatregelen die geschikt zijn voor de biologische agentia die u gebruikt, rekening houdend met de bioveiligheidsniveau (s) van de soort. Om te voorkomen dat besmetting van uw instrument en het gas overdracht lijnen met levensvatbare biologische agentia, installeren filters van de juiste poriegrootte in het draaggas lijn. De filters zullen niet interfereren met de overdracht van vluchtige stoffen naar de Sesi reactie kamer, maar kan enigszins invloed hebben op de efficiëntie van aerosol overdracht. 6 Gebruik secundaire containment of een kast bioveiligheid bij het bevestigen van het gas overdragen dop om je cultuur fles om de juiste insluiting te verzekeren in het geval van morsen biologische agentia. Initiëren en beëindigen draaggasstroom om uw monsterfles op een manier die niet zal bouwen druk in de fles. 3. Instrument optimalisatie LET OP: Sesi-MS is speciaal ontworpen om te proeven van vluchtige stoffen, zo beperk het gebruik van geurige persoonlijke verzorging (bijvoorbeeld, de cologne, mondwater, lotions, wasverzachter), gom, sigaretten, etc. voordat u het instrument. Strak cap alle vluchtige chemicaliën in het lab, en controle luchtstromen zoveel mogelijk tijdens het testen. De volgende instrumentele parameters, die alle van invloed op het signaal intensiteit en stabiliteit, zal moeten worden geoptimaliseerd voor uw instrument en experiment. Electrospray oplossing en debiet: Kies de juiste electrospray oplossing voor de klasse van moleculen die u wilt targeten, rekening houdend met de operationele instrument polariteit (positief of negatief-ion-modus) en moleculaire karakter van het doel verbindingen. In dit experiment de electrospray-oplossing is 0,1% mierenzuur, 5,0% methanol, 94,9% water (v / v), die het signaal intensiteit van minder polaire moleculen vergroot while het verstrekken van goed signaal stabiliteit. De oplossing wordt geleverd met een debiet van 5 nL / s. Draaggasstroom rate: De vervoerder gasstroom kan de electrospray stabiliteit en de intensiteit van het signaal beïnvloeden. CO 2 (≥ 99,99%) bij een debiet van 2 l / min wordt hier gebruikt. Naald vorm en functie: De naald vorm en positie sterk beïnvloeden het signaal intensiteit en stabiliteit. Bij het installeren van een nieuwe naald, moet de positie van de naald worden geoptimaliseerd om een ​​evenwicht te vinden tussen lage achtergrond, hoge analyt signaal intensiteit, en het signaal stabiliteit te creëren. Met het oog op Sesi spectra te reproduceren na een naald te veranderen, is het noodzakelijk om periodiek verzamelen van spectra als u de naald positie totdat u in staat zijn om de waargenomen spectrum af te stemmen op uw administratie. De afstand van electrospray naald om massa spec opening zal worden 1 – 5 mm. Aangelegde spanning: De spanning die wordt toegepast op het systeem van invloed op de signaal-ion intensiteit en de stabiliteit van de electrospray Taylor kegel. Daarnaast is de optimale spanning is afhankelijk van uw electrospray oplossing en de naaldpunt vorm. Aan het begin van de reeks experimenten, bepalen de spanning die de optimale spectrum en signaal stabiliteit opbrengst voor uw systeem, en gebruik dan deze spanning voor alle volgende experimenten. Voor ons systeem, toegepast voltages van 2,0 tot 5,0 kV zorgen voor een optimale signaal intensiteit en electrospray stabiliteit. Voor dit experiment 2,5 kV wordt gebruikt. 4. Het inschakelen van en afstemming van de Sesi-MS voor analyse Begin door ervoor te zorgen dat de spanning is uitgeschakeld en dat het systeem wordt geloosd van elektriciteit. Doe dit door 1) het waarborgen van de indicatielampjes op de voedingsspanning worden uitgeschakeld, 2) zorgen voor de spanning op de multimeter is nul, en 3) aarding van de elektrische leidingen. Installeer de juiste electrospray oplossing voor uw experiment. Zet op de drager gas en zet de stroom naar het tarief geschikt is voor uw experiment. Druk op de electrospray reservoir om de levering van de electrospray oplossing om de reactie te kamer te initiëren. Schakel de voedingsspanning en stel de spanning naar een geschikte waarde voor uw experimenten. NB: Op dit punt van de metalen oppervlakken van de ionisatie bron kunnen leveren van een gevaarlijke schok. Oefening grote voorzichtigheid bij het werken rond het instrument zodra de voedingsspanning is ingeschakeld. Stel een tuning methode voor het toezicht op de Sesi-MS spectrum, terwijl het maken van fijne afgestemd aanpassingen aan de aangelegde spanning. Gebruik de acquisitie parameters die je hebt geoptimaliseerd voor uw systeem en uw experiment. Zo duidelijk de Multiple Channel Acquisition (MCA) in te schakelen (indien van toepassing) dat elke scan een onafhankelijke spectrum produceert, stelt de overname de tijd tot 10 – 15 min, en start de acquisitie. Spectra van het draaggas achtergrond moet nu worden genomen. Maak afgestemd aanpassingen aan de aangelegde spanning om een stabiel totaal ion chromatogram (TIC) en reproduceerbare scans dat de CO 2-scans voor uw vorige experimenten passen te verkrijgen. Zodra de spanning aanpassingen zijn gemaakt, blijven spectra en een TIC in te zamelen voor vijf minuten om ervoor te zorgen het instrument is gestabiliseerd. Zodra instrumentale stabiliteit is gewaarborgd, het opzetten van de overname methode geschikt is voor uw monsters, het aanpassen van de overname tijd, gegevensbereik en MCA selectie als dat nodig is. Verzamel een draaggas achtergrond spectrum voor uw administratie. 5. Het verkrijgen van een vluchtige vingerafdruk van je bacteriecultuur Voor het verzamelen van een leeg spectrum, direct de vervoerder gasstroom door de bypass lijnen, en bevestig vervolgens het blanco monster (kleppen gesloten) om het gas overdracht lijnen van het instrument. Open de kleppen aan de monsterfles, en sluit de kleppen van de bypass lijnen. Laat het systeem equilibreren gedurende 30 seconden, gedurende welke tijd de luchtvochtigheid in de reactie kamer stabiliseert. Deze periode van evenwicht is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare spectra. Om ervoor te zorgen dat het systeem in evenwicht is, kan u de TIC, die zal veranderen tijdens de periode evenwicht bewaken, en te stabiliseren daarna. Zodra het systeem is in evenwicht gebracht, initiëren spectrum collectie. Nadat het spectrum wordt verzameld, verwijdert u de monsterfles door eerste opening van de vervoerder gas bypass lijnen, daarna sluiten van de kleppen monster, en tenslotte het verwijderen van de monsterfles. Spoel het systeem met de draaggas voor 2 – 4 minuten, het verwijderen van het vocht en geadsorbeerd vluchtige stoffen uit de overdracht lijnen, het voorkomen van sample-to-sample overdracht. Herhaal de stappen 5,2 tot 5,5 voor elke bacteriële monster, met tussenpozen het verzamelen van extra lege spectra een grondige blanco aftrekken te verzekeren. Onvolledige blanco aftrekken zal leiden tot deverschijning van chemische achtergrond pieken in uw verwerkte spectrum die gemeenschappelijk zijn voor atmosferische druk ionisatie technieken (bijvoorbeeld ftalaten, siliconen, etc.). 9 Bij het verzamelen van uw spectra, ervoor zorgen dat de signalen niet ion de lineaire detectielimieten van uw instrument, zoals bepaald door de TIC en de maximale intensiteit van individuele pieken van meer dan. Ionen overschrijding van de bovenste grenzen van de detector van uw instrument kan genereren artefact pieken die niet representatief zijn voor uw monster. 6. Representatieve resultaten Als een voorbeeld van de Sesi-MS spectra die verkregen kan worden voor bacteriële vluchtige stoffen, het positieve ion-modus vluchtige vingerafdrukken ten behoeve van E. coli en P. aeruginosa aëroob gekweekt in LB-Lennox gedurende 24 uur bij 37 ° C worden weergegeven (afb. 2). De E. coli vluchtige spectrum wordt gedomineerd door de indool bij m / z = 118, waardoor E. coli culturen hun karakteristieke geur, terwijl het spectrum van P. aeruginosa bevat een grotere variëteit van protoneerbare pieken. Houdt u er rekening mee dat de relatieve intensiteiten van de pieken in de vluchtige spectrum zijn afhankelijk van de instrumentale parameters beschreven in hoofdstuk 3. Deze parameters moeten goed worden bediend vanaf experiment om te experimenteren met het oog op reproduceerbare spectra te verkrijgen. Figuur 2 Blanco-gecorrigeerde positieve ion-modus Sesi-MS spectra (20 – 150 m / z). Van E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1 vluchtige stoffen na 24 uur aërobe groei in de LB-Lennox bij 37 ° C. Voor meer details over de pieken waargenomen in de Sesi spectra, verwijzen wij u naar Zhu, et al.. 8.