Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study
Summary
Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.
Abstract
Om te oefenen hun functie lymfocyten moet het bloed te verlaten en in verschillende weefsels in het lichaam migreren. Lymfocyten hechting op endotheliale cellen en weefsels extravasatie is een complex proces gecontroleerd door verschillende adhesiemoleculen (homing-receptoren) uitgedrukt op lymfocyten en hun respectieve liganden (addressins) getoond op endotheelcellen 1 2. Ook al is de functie van deze receptoren hechting kan gedeeltelijk worden bestudeerd ex vivo, de ultieme test voor hun fysiologische relevantie is om hun rol te evalueren tijdens de in-vivo-lymfocyten adhesie en migratie. Twee complementaire strategieën zijn gebruikt voor dit doel: intravitale microscopie (IVM) en homing experimenten. Hoewel de IVM is essentieel om de precieze bijdrage van specifieke adhesie receptoren tijdens de hechting cascade in real time en in verschillende weefsels te definiëren, IVM is tijdrovend en arbeidsintensief, vaak de ontwikkeling van geavanceerde chirurgische technieken vereist, moet het voorafgaande scheiding van homogene celpopulaties en het mogelijk maakt de analyse van slechts een weefsel / orgaan op een bepaald moment. Daarentegen, concurrerende homing experimenten laat de directe en gelijktijdige vergelijking in de migratie van twee (of zelfs meer) cel subsets in dezelfde muis en ze ook toestaan dat de analyse van een groot aantal weefsels en van een groot aantal cellen in hetzelfde experiment.
Hier beschrijven we de klassieke concurrerende homing protocol dat wordt gebruikt in het voordeel / nadeel van een bepaald celtype te bepalen naar huis om specifieke weefsels in vergelijking met een controle-celpopulatie. We hebben ervoor gekozen om de trekkende eigenschappen van darm-tropische versus niet gut-tropische T-cellen te illustreren, omdat het darmslijmvlies is de grootste lichaamsoppervlak in contact met de externe omgeving en het is ook de extra-lymfoïde weefsel met de beste gedefinieerde trekkende eisen . Bovendien heeft recent werk vastgesteld dat de vitamine A metaboliet all-trans retinoïnezuur (RA) is de belangrijkste moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor het induceren van darm-specifieke aanhechting receptoren (integrine a4b7and chemokine-receptor CCR9) op lymfocyten. Zo kunnen we snel grote aantallen van darm-tropische als niet-tropische darm lymfocyten ex vivo door het activeren van T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van RA, respectievelijk, die uiteindelijk kan worden gebruikt in de concurrerende homing experimenten hier beschreven.
Protocol
Discussion
Hoewel homing experimenten zorgen voor een zeer waardevolle informatie over de migratie van het totaal celpopulaties in een bepaald weefsel, moet in gedachten worden gehouden dat deze testen niet rechtstreeks endotheel hechting daarom te analyseren en niet discrimineren, waarin stap (pen) van de meerstaps hechting cascade (tethering / rollen, activering of plakken) een bepaalde homing receptor optreedt. De gouden standaard om de specifieke rol van de homing-receptoren te definiëren in de hechting cascade is intravitale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EJV wordt ondersteund door een beurs van de Crohn en Colitis Ulcerosa s Foundation of America (CCFA). JRM wordt ondersteund door subsidies van CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) en New Innovator NIH directeur s Award.
Materials
Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.
ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).
PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).
Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.
T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.
Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.
Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).
References
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
- Mora, J. R. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J Exp Med. 201, 303-316 (2005).
- Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
