Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

1. Probenentnahme und Vorbereitung Sammeln venösen Blut von Patienten mit Sepsis Verdacht und legte sich in zwei BACTEC (BD, Sparks, MD) Blutkulturflaschen, eine aerobe und eine anaerobe, zusammen mit einem Blut Kultur gesetzt. Legen Flaschen in die BACTEC 9240 Instrument bei 35 ° C. Inkubieren, bis das Gerät in den Alarmzustand wegen des Wachstums der Organismen in der Blutkulturflasche ausgelöst wird. Entfernen Flasche aus der Blutkultur Instrument. 2. Vorbereitung der Reagenzien vor dem Färben Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 4 ml 60x Waschlösung von 240 ml frisch destilliertem Wasser direkt auf die Färbung Dish gefolgt. Legen Sie die Färbung Gericht in der 55 ° C Wasserbad zu erwärmen. Bewahren Sie die restlichen Konzentrat bei 2-8 ° C. Entfernen Sie die Eindeckmedium aus dem Kühlschrank und auf Raumtemperatur erwärmt. 3. Gram-Färbung Vorsichtig schwenken die Blutkulturflasche. Mit einer Nadel und Spritze oder eine Subkultivierung Apparat, entfernen Sie das Blut (ca. 5 ml) aus der Flasche und in eine sterile Schraube Röhrchen. Mit einer sterilen Pipette, stellen Sie einen großen Tropfen Blut auf einen Objektträger. An der Luft trocknen schieben und fixieren in Methanol für 10 Sekunden. Lassen Sie gleiten an der Luft trocknen. Führen Sie eine Gram über die Blut-Film Fleck, um die Morphologie des Organismus wächst in der Blutkulturflasche bestimmen. Mit einer Ölimmersion, Diashows. Gram-positive Kokken in Paaren und kurzen Ketten auf die Gram-Färbung zu beobachten ist am ehesten mit Enterococcus Spezies. Das Gram-Färbung Ergebnis treibt dann die Auswahl der richtigen PNA FISH-Sonde Kit für Identifizierung von Bakterien verwendet werden. Diese Blutkultur wird gebeizt mit der E. werden faecalis / OE PNA FISH-Färbung. 4. PNA FISH Stain Mischen Sie die Röhrchen mit dem Blut vorsichtig durch Schwenken vor Abstrich Vorbereitung. Geben Sie einen Tropfen der Lösung Fixation auf das Wohl eines PNA FISH Objektträger. Transfer 10 ul oder einen kleinen Tropfen aus der Tube mit der positiven Blutkultur auf die Fixation Solution und vorsichtig mischen, um zu emulgieren. Fix die Flecken durch Erhitzen für 20 min. bei 55 ° C auf einer Heizplatte. 5. Quality Control Material- Eine positive und eine negative Qualitätskontrolle schieben muss jede Charge von Folien für die Färbung getestet werden. Verwenden Sie E. faecalis / OE Objektträger gekauft AdvanDx für diesen Zweck oder bereiten Abstriche aus flüssigen Kulturen Referenz Stämme von E. faecalis und E. faecium als positive Kontrolle entweder auf separaten Folien oder gemischt auf einer Folie und Staphylococcus spp oder Streptococcus spp als negative Kontrolle Material. Die QC-Ergebnisse sollten in der Lage, für eine angemessene Prüfbedingungen, insbesondere in den Hybridisierungsstringenz und Zellwand Eindringen zu überwachen, da PNA-Methodik wurde entwickelt, um Zellwand Eindringen optimieren 6. Hybridisierung Einen Tropfen E. faecalis / OE PNA, die auch auf dem Objektträger mit dem Abstrich. Add Deckglas. Vermeiden Sie Luftblasen. Inkubieren für 30 ± 5 min. bei 55 ± 1 ° C auf Heizplatte Nach der Inkubation Objektträger in Spannplatte 7. Strenge Wash Tauchen Objektträgerhalter in den vorgeheizten Waschlösung bei 55 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Oft gleitet das Deckglas ab, indem Sie vorsichtig Schütteln der Folie in der Waschlösung. Gelegentlich muss das Deckglas vorsichtig geschoben werden Sie mit einer Pinzette. Inkubieren in der Waschlösung für 30 ± 5 min. bei 55 ± 1 ° C. Entfernen Sie die Folien aus der Waschlösung Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen 8. Montage Einen Tropfen Eindeckmedium auf jeder Folie Add Deckglas. Vermeiden Sie Luftblasen. Untersuchen Sie die Folie auf einem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 2 Stunden. Setzen Sie die Dias dem Sonnenlicht oder anderen starken Lichtquellen direkt, da dies zu Fluoreszenzlöschung führen kann. 9. Interpretation der Ergebnisse Die Fluoreszenz-Mikroskop für Dia-Prüfung verwendet werden, müssen mit dem AdvanDx Dual-Band-Filter und ein 60x oder 100x Öl-Objektiv ausgestattet werden. Die QC Dias sollte zunächst geprüft werden, um zu bestätigen, dass die Hybridisierung entstanden sind. E. faecalis sollte so hell grün fluoreszierende Kokken in mehrere Felder der Ansicht angezeigt werden und die E. faecium wird als leuchtend rote Kokken erscheinen. Non-Enterokokken Steuerschieber erscheinen soll nichtfluoreszierenden. Nach der Bestätigung des Systems in der Kontrollgruppe, kann der Patient gleitet untersucht werden. Auf den ersten Blut film erscheint rötlich, aber die leuchtend rot und grün Kokken werden ganz offensichtlich. Abbildung 1. Repräsentative Beispiele für grün-positive E. faecalis (links), rot positive E. faecium (Mitte) und negative (rechts) Testergebnisse. 10. Repräsentative Ergebnisse Drei Institutionen wurden in einer multizentrischen klinischen Studie zur Evaluierung dieser PNA FISH-Färbung und Vergleich einer 2,5 Stunden Protokoll, um die verkürzte 1,5 Stunden Protokoll, das soeben Bewertung einbezogen. Ein insgesamt 152 Routine grampositive Kokken in Paaren und Ketten (GPC) positive Blutkultur Flaschen wurden in die Studien einbezogen. Es gab 100% (152/152) Vereinbarung zwischen den Ergebnissen der modifizierten und dem ursprünglichen Testverfahren für E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 anderen Enterokokken und 78/78 anderen GPC (Tabelle 1). Diese Färbemethode hatte exquisite Sensitivität und Spezifität in dieser klinischen Studie (Tabelle 2). Routine-Methoden E. faecalis / OE PNA FISH Standard-Vorgehensweise E. faecalis / OE PNA FISH Short Procedure E. faecalis 41 41 (Grüne Positive) 41 (Grüne Positive) E. faecium 27 27 (Red Positive) 27 (Red Positive) E. casseliflavus 2 2 (Red Positive) 2 (Red Positive) E. gallinarum 2 2 (Red Positive) 2 (Red Positive) Andere Enterococcus spp. 2 2 (Red Positive) 2 (Red Positive) S. pneumoniae 17 17 (Negative) 17 (Negative) S. viridans 33 33 (Negative) 33 (Negative) S. mitis 1 1 (Negative) 1 (Negative) S. pyogenes 3 3 (Negative) 3 (Negative) S. bovis 2 2 (Negative) 2 (Negative) S. salivarius 1 1 (Negative) 1 (Negative) S. sanguinis 2 2 (Negative) 2 (Negative) S. agalagtae 7 7 (Negative) 7 (Negative) Andere Streptococcus spp. 7 7 (Negative) 7 (Negative) Abiotrophia spp. 3 3 (Negative) 3 (Negative) Peptostrepococcus spp. 2 2 (Negative) 2 (Negative) Gesamt 152 152/152 100% Zustimmung 152/152 100% Zustimmung Tabelle 1. Listing von Bakterien getestet sowohl mit dem Standard (2,5 Stunden) und Rapid (1,5 h)-Protokoll. Empfindlichkeit E.faecalis Empfindlichkeit Andere Enterococcus spp. Spezifität 100% (41/41) 95% CI (93,0 bis 100) 100% (33/33) 33/33 95% CI (91,3 bis 100) 100% (78/78) 95% CI (96,2 bis 100) Tabelle 2. Sensitivität und Spezifität der 1,5 Stunden PNA FISH-Protokoll.